[发明专利]一种筛查ALK融合基因的方法

说明书

技术领域

本发明属于医药和生物技术领域，涉及ALK融合基因的筛查方法，尤其是ALK融合基因筛查的多片段引物及其应用。

背景技术

据研究报道，对于非小细胞肺癌(NSCLC)，针对特定的靶点开展个体化治疗已成为现实，例如通过检测表皮生长因子受体(EGFR)基因突变，筛选适合EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)治疗的患者亚群。据美国麻省总医院研究人员发表研究论文称，检测一种间变淋巴瘤激酶(ALK)融合基因如(EML4-ALK)，可对NSCLC患者作进一步细分。

ALK融合基因于2007年开始见诸NSCLC相关研究报告。在此之前，研究者已经在多种肿瘤中识别了涉及ALK的基因变异，例如间变性大细胞淋巴瘤、炎性成肌纤维细胞瘤和成神经细胞瘤等，但不包括肺癌。

现有技术公开了ALK融合基因迄今已发现多种变异类型。分析这些融合基因的结构发现，其ALK部分均包括开始于第20外显子的编码细胞内酪氨酸激酶结构域的基因片段。经检测，所有这些融合基因均有生物学功能，其表达产物为一种嵌合酪氨酸激酶。

传统上对ALK融合基因的筛查包括两种主要形式：1、普通PCR，通过设计引物，对某一种具体的融合形式进行扩增，根据琼脂糖凝胶电泳判断结果；2、荧光原位杂交(FISH)，通过荧光标记的DNA探针特异性地与肿瘤组织DNA中ALK基因5’端和3’端进行杂交，结果在荧光显微镜下判读。

对于普通PCR筛查方法，实践显示其具有以下明显缺陷：由于ALK融合基因的具体形式众多，所以至少需要设计多对PCR引物，分别进行多次PCR反应，费时费力；并且如果样本是一种新的ALK融合形式(具有未知的“伙伴基因”)，则使用此方法则无法有效地进行检测，而出现假阴性的结果。

对于荧光原位杂交(FISH)，虽然目前被认为是诊断融合基因的金标准，但是其价格高昂，实验步骤复杂，对操作人员的技术水平要求极高，致使其亦无法进行推广。因此，目前临床实践中需要提出更加简单、方便、灵敏的ALK融合基因的筛查工具和筛查方法。

发明内容

本发明的目的是为克服现有技术所存在的缺陷与不足，提供一种新的筛查ALK融合基因的方法，尤其涉及ALK融合基因的real-time PCR联合引物及其应用。

本发明提供了筛选ALK融合基因的real-time PCR联合引物。

本发明的进一步目的是提供上述real-time PCR联合引物在筛查ALK融合基因方法中的应用，本发明方法能准确、简捷、经济、直观地判断ALK融合基因存在与否。

本发明的筛查ALK融合基因方法，以样本中的总RNA反转的cDNA为模板，加入real-time PCR联合引物，进行实时荧光聚合酶链反应，并通过检测反应产物中反应单位间Ct值的差值检验是否具有ALK融合基因。本方法具有操作简捷，节约时间，结果判断直观、明确，成本较低，污染减少的特点。

具体而言，本发明提供的一种筛选ALK融合基因的方法，其特征在于，其包括如下步骤：

(1)设计筛查ALK融合基因的7对real-time PCR联合引物或探针；

(2)提取样本中的总RNA；

(3)以样本中的总RNA为模板，通过逆转录方法合成cDNA；

(4)在7个real-timePCR反应单位中，以(3)中所得的cDNA为模板，分别加入(1)中设计的7对引物或探针，以及包括荧光染料在内的反应预混液；

(5)在real-time PCR反应仪上进行real-time PCR反应，并分别记录每个样本的7个反应单位的荧光阈值(Ct值)；

(6)分别计算引物或探针I～IV所在反应体系的Ct值的均值Ct_ABP，和引物或探针V～VII所在反应体系的CT值的均值Ct_BBP；

(7)计算相对表达量值2^-ΔCT，其中-ΔCT＝-(Ct_ABP-Ct_BBP)；如2^-ΔCT大于12，则认为该样本具有ALK融合基因。