[发明专利]一种从HE染色片提取残微核酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及核酸的提取方法，具体涉及一种从HE染色片提取残微核酸的方法。

背景技术

HE染色是常用的病理制片方法，广泛用于病理诊断和研究。HE染色片是采用两种生物染料即碱性染料苏木素和酸性染料伊红分别于细胞核和细胞质发生作用，使细胞的微细结构通过颜色而改变它的折光率，从而在光镜下能清晰地呈现出细胞图像，组织细胞内含有酸性物质和碱性物质，细胞的酸性物质与碱性染料的阳离子结合，而细胞核的碱性物质与酸性染料的阴离子结合，使其中酸性细胞核被碱性的苏木素染成蓝色，而碱性的胞浆被酸性染料伊红染成红色，其结果胞核呈蓝色，胞浆呈红色。一方面，经过HE染色的穿刺组织、细胞涂片（包括痰和尿）、胃肠镜等常规病理HE染色片的肿瘤细胞中含有碱性染料苏木素和酸性染料伊红，造成偏酸或偏碱的外界条件，从而对核酸链中的磷酸二酯键有破坏作用，同时生物染料酸根基团与核酸分子结合，阻抑了磁珠和柱子吸附核酸分子的过程，此外HE染色前细胞经过福尔马林一段时间的固定，使细胞DNA/RNA链被破坏氧化损耗断裂，这些因素直接影响从HE染色片提取的核酸的质量。另一方面，HE染色片在制作过程由于碱性水漂洗和弱酸染料的中和，及时中断了福尔马林的氧化破坏后，又被优质的核酸固定剂乙醇固定保护，之后组织细胞中的核酸被生物染料弱酸碱根长期均质化结合，在树脂和封片密闭环境中保护了残存的核酸物质，所以HE染色片细胞中残留尚未损耗断裂的微量核酸，在核酸序列完整性上优于保存在蜡块内的组织细胞。相反，蜡块组织保存的细胞持续的在残留的福尔马林环境中氧化破坏，福尔马林气体很难在密封的石蜡固体环境逸出，数月后就产生大量的核酸碎片，很难得到正常长度的核酸片段，使PCR产物出现二聚体导致特异性扩增失败。对后续满足核酸检测量的需要和检测准确性造成的重大不利影响；不能保证稳定性要求极高的临床检测顺利成功进行下去。

目前，常用的核酸提取方法包括：磁珠法、溶胞法、自动提取法、硅藻玻璃粉吸附法和低温酶解法等。在中国专利申请97125650.0中，公开了一种从石蜡包埋组织中提取核酸进行基因扩增的方法，采用二甲苯脱蜡法或水浴脱蜡法，再提取核酸DNA进行基因PCR扩增。在中国专利申请03113637.0中，公开了一种核酸自动提取机，可以完成血液、精液和其它体液样品定量吸取、转移，试剂自动定量添加、振荡，一次性吸液器的装卸，样品控温加热，离心试管合盖，按需自动分离等一系列提取核酸工序的自动化操作。在中国专利申请89104591.0中，公开了一种核酸提取新工艺，是用低温酶解法的高效率提取核酸的新方法。在中国专利申请94110993.3中，公开了一种脱氧核糖核酸（DNA）提取工艺，提出了一种从鱼的性腺体如鱼的精巢中提取DNA的生产工艺。在中国专利申请94106094.2中，公开了一种核糖核酸(RNA)的提取方法，从新鲜海产品中摘取内脏，低温保存后置入碱性缓冲液中，再向上清中加入聚乙二醇沉淀、溶解后加入有机酸，析出变性蛋白，上清再沉淀、洗涤、干燥，即可得到RNA。在中国专利申请98110654.4中，公开了一种核酸快速抽提方法，采用乙醇、焦碳酸二乙酯混合溶液，与一定比例的待测标本混合，经反应、浓缩、离心后，即可得到用于PCR或RT－PCR的核酸溶液。在中国专利申请200810200588.X中，公开了一种应用纳米磁珠纯化核酸的试剂盒，可以从人血浆或血清或尿液中纯化出病毒及革兰氏阴性菌的核酸，可以快速、灵敏的大规模纯化核酸。上述这些技术和工艺均是针对新鲜组织细胞，血液或石蜡组织等检材，没有涉及这些检材后续的HE染色片上的靶细胞残微核酸提取和纯化，因此针对以HE染色片为原材料进行残微核酸的提取还处于空白阶段。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种从HE染色片提取残微核酸的方法，通过利用化学上同离子竞争效应解除核酸分子的弱酸根染料基团的结合，可以针对HE切片中残存的长片段核酸进行有效提取和纯化，获得高质量的核酸。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种染色细胞核酸提纯技术，简称染色核酸提纯（tained nucleus-TN），是从HE染色片提取残微核酸的方法：先用低浓度盐酸乙醇作脱色剂对HE染色片进行脱色，然后用草酸水溶液漂白，再富集靶细胞，最后对富集的靶细胞进行核酸提取即可。具体步骤包括：

（1）将HE染色片浸入二甲苯30min及以上，轻滑掉盖玻片并取出，继续浸泡HE染色片8~12h，更换入新二甲苯，充分祛除中性树胶，得细胞片；更换入新二甲苯，浸泡15~20min；