[发明专利]构建核酸库的方法、试剂及试剂盒

说明书

技术领域

本发明为建立核酸库提供了方法、试剂及试剂盒。特别是在建库过程中使用了转座酶、核酸酶和连接酶。

背景技术

怎样有效和高效地用各种不同材料的DNA和RNA来建立文库，这对第二代测序(NGS)的研究人员和操作人员来说是一个挑战。现有的技术，包括通过物理手段：超声波法或雾化法来打断双链DNA，这需要较大量的起始材料。这个过程是漫长的，很难以高通量的方式进行。NEB的科学家最近开发使用Fragmentase，在离心管中进行酶反应，这和物理打断相比是一个不错的选择，但仍然需要大量的起始材料。EPICENTRE公司开发了Nextera试剂，从而使研究人员能够在2小时内完成建库过程，并且起始材料只要50ng。然而，它需要的测序引物与现有的测序平台的测序引物不兼容，这是让许多潜在用户感到失望的一点。

第二代测序建库领域面临的另一个挑战是，测序平台发展非常快，新测序仪的研发只需要几年的时间，更新换代很快。第三代测序技术也有可能在不久的将来会对第二代技术进行挑战或替换。新技术和设备的快速发展，为那些只需进行很小的调整，就能将建库技术应用于新的仪器和技术平台的建库产品带来了技术和商业上的竞争力，也为那些企业带来了巨大的商业机会。

本发明的目的是建立一个文库的制备方法，可用于所有现有的和即将推出的极少改动的新测序仪，可以用于高通量，并适用于机器操作，只需要较少的起始材料，即可产生满意的测序结果。

发明内容

本发明提供了随机断裂并同时标记DNA片段的方法，组分和试剂盒。特别是，本发明采用体外转座，用核酸酶和连接酶来标记核酸库以适合下一代测序应用。

在一些实例中，本发明方法为随机断裂并同时标记DNA片段提供了方法，适用的DNA片段可以是纯化的基因组DNA，双链的cDNA，PCR后的双链DNA产物，或是滚环复制产生的大片段DNA，这些DNA的来源可以是人，动物，植物或者微生物。

其中包括：a)将转座酶和转座子末端序列(Transposone End-TE)与双链目标DNA混合，在转座酶的催化作用下，双链的转座子随机插入目标DNA序列中。转座酶可以包括：(Tn5，Tn3，Tn7，Tn8，Tn9，Tn10，Tn11，Tn2，Tn4，Tn6以及它们的各种突变版本。在转座子插入过程中，转座子末端的一条单链以共价键连接在DNA片断的5’端，转座子末端的第二条链与DNA片断不相连，但是在退火条件下，仍以双链形式存在。在第二链的转座末端和DNA片段3’端之间有9个碱基的空位。由此就产生了随机断裂的，并被(TE)标记的DNA片段。这些片段从5’至3’，始于双链转座子末端序列，继而是9个碱基对的单链DNA序列，然后是双链目标DNA片段，9bp的单链DNA序列和双链转座子末端；b)从转座子末端序列(TE)标记的DNA片断中去除双链转座子末端序列(TE)，生成未标记的DNA片段；c)在未标记的DNA片断上连接需要的DNA标记，产生一个新的有标记的DNA片段。

在一些实例中，转座子可以包括：(Tn5)，转座子末端序列可以包括(TE)。

在本发明的一些实例中，单链DNA内切酶被用来切割9个碱基转座子末端序列(TE)标记的DNA上9个碱基的单链区域，目的是移除双链转座子末端序列。许多单链DNA内切酶能够用来去除单链DNA，以此除去DNA两端双链转座子末端序列，产生带有平末端的未被标记的双链DNA片断。在另外一些实例中，用DNA聚合酶来补平5’端，在3’端加上A尾。适用于这一应用的聚合酶不仅仅局限于DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶，大片段DNA聚合酶I(Klenow片段)也可以使用。Klenow片段是去除了3’到5’外切酶活性的DNA聚合酶I。而用DNA聚合酶补平5’端，形成平末端(而不是A尾)，则要用有3’到5’外切酶活性的DNA聚合酶，如T7DNA聚合酶，T4DNA聚合酶，大片断DNA聚合酶I等。

在一些实例中，转座子末端的第二条链，是游离的，并不和目标DNA序列共价连接。在高温条件下，转座子末端序列(TE)标记的DNA片段被分离，而目标DNA部分保持不变。在移除转座子末端的第二条链后，可以使用一些特定的单链DNA核酸酶来移除剩下的转座子的第一条链和9个碱基对的单链DNA。