[发明专利]SOD基因修饰间充质干细胞的构建方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于干细胞技术领域，尤其涉及一种SOD基因修饰间充质干细胞的构建方法及其应用。

背景技术

急性辐射综合症(ARS)发生在临床肿瘤患者的放疗及核恐怖、核事故中, 人体中细胞更新快、代谢迅速的组织对辐射尤为敏感， 如造血组织、肠道组织等。在经历2010年日本福岛核泄漏事件后，各国均开始对核安全问题重新重视起来。寻找更有效的治疗和预防ARS的治疗手段，是关系到国家安全、国民健康的重要任务。对于ARS的治疗，常规使用一些支持疗法，包括输血、补液、电解质、抗生素以及抗病毒药物，但治疗效果并不明显。当前，国内外均未开发出有效的预防和治疗ARS的药物。

超氧化物歧化酶 ( Superoxide dismutase，SOD)是一种广泛存在于生物体内，能清除生物体内的超氧阴离子自由基，维持机体中自由基产生和清除动态平衡的一种金属酶。具有保护生物体，延缓衰老和治疗疾病等作用。由于受到半衰期短，相对分子量大，不易透过细胞膜，口服时易被胃蛋白酶分解等因素的限制，外源SOD很难作为药用酶广泛应用于临床中。因此，针对SOD的转基因治疗逐渐成为研究热点。

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）是骨髓基质中的主要干细胞，是成纤维细胞、内皮细胞、成骨细胞、脂肪细胞等多种骨髓基质细胞的前体细胞。体外扩增的间充质干细胞（MSC）植入体内后可长期存活，仍保持其多向分化潜能，并且在损伤环境中还可以被诱导扩增，参与组织修复或再生反应。当前，针对MSC基因修饰的实验研究才刚刚兴起，国内外尚无基因转染MSC治疗ARS的相关报道。

发明内容

为解决现有技术存在的问题，发明人出乎预料地发现，将SOD3基因连接到腺病毒载体中并感染间充质干细胞，得到的EC-SOD过表达间充质干细胞对辐射小鼠治疗效果良好，可延长辐射小鼠的存活期，从而完成本发明。

本发明提供一种SOD基因修饰间充质干细胞的构建方法，包括如下步骤：

A）  将SOD3基因连接到腺病毒载体上，得到重组腺病毒载体；

B） 培养293细胞系，利用Lipofectamine转染试剂将重组腺病毒载体与包装质粒共转染到293细胞系中，常规培养10～12 天，至293细胞系完全出现病变效应，收集得到腺病毒毒株，保存毒株并确认SOD3基因已成功连接到腺病毒载体上；

C） 将腺病毒毒株进行大量扩增，感染293细胞系，经观察细胞出毒后收集腺病毒病毒液，对其进行超滤纯化浓缩，测定上清液中腺病毒的滴度；

D）  腺病毒病毒液（SOD3-腺病毒）分别以不同条件感染间充质干细胞，确定感染的最佳条件，得到SOD基因修饰间充质干细胞。

采用上述技术方案，本发明方法可得到EC-SOD基因的过表达的SOD基因修饰间充质干细胞，其胞内SOD蛋白含量增多，细胞培养液中的SOD相对活性明显增强；将SOD基因修饰间充质干细胞应用于辐射小鼠的治疗，可取得良好的治疗效果，可延长辐射小鼠的存活期。

作为本发明的进一步改进，所述腺病毒载体采用穿梭质粒pDC315。

作为本发明的进一步改进，所述包装质粒采用pBHGloxΔE1和3Cre质粒载体。

作为本发明的进一步改进，所述感染的最佳条件为50MOI病毒液结合5μM HP4短肽。

本发明还提供所述SOD基因修饰间充质干细胞的构建方法构建的SOD基因修饰间充质干细胞在制备治疗急性辐射综合症的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：采用本发明提供的构建方法，可得到EC-SOD过表达的SOD基因修饰间充质干细胞，其胞内SOD蛋白含量增多，细胞培养液中的SOD相对活性明显增强；将SOD基因修饰间充质干细胞应用于辐射小鼠的治疗，可取得良好的治疗效果，可延长辐射小鼠的存活期，在制备治疗急性辐射综合症的药物方面具有广阔的应用前景。

附图说明

图1 为GFP标记的不同滴度腺病毒病毒液结合5μM HP4短肽感染MSC结果示意图。

图2 为MTT法测定50MOI腺病毒病毒液与5μM HP4多肽共同感染MSC48小时细胞存活率结果示意图。

图3 为流式细胞仪分别检测感染与未感染SOD3-腺病毒的MSC表面相关抗原结果示意图。

图4 为感染SOD3-腺病毒的MSC分化结果示意图。