[发明专利]一株耐冷假单胞菌Den-05及其筛选方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程、环境工程技术领域。涉及菌株Pseudomonas psychrophilia Den-05（耐冷假单胞菌Den-05）及其筛选方法和在低温条件下城市污水处理中的应用。 

背景技术

水体中适量的氮是合成藻类等微生物的基本元素，是形成水生生态环境重要的物质条件，也是水环境良性循环的基础。但目前我国一些水体中氮的总量已超过水体容量，过量的氮元素导致水体藻类等生物异常增殖，引起水质恶化。同时，氨氮和亚硝酸盐氮对鱼类等生物有毒害。由于水体中氮素的各存在方式在一定条件下会循环转化，如何控制水体中氮的污染，就成为目前和整个“十二五”减排过程都必须面对的话题。我国已开始执行《城市污水处理厂污水综合排放标准》(GB18918-2002)一级A标准 (氨氮<5mg/L，TN<15mg/L)，城市污水处理的重点目标已经转向氮磷等有机营养物质的去除。因此，开发经济高效的生物脱氮方法和技术已成为水污染控制领域热点之一。 

一般认为，进行硝酸盐呼吸的反硝化细菌都是兼性厌氧微生物，因为只有在无氧条件下，才能诱导出反硝化作用需要的硝酸盐还原酶A和亚硝酸盐还原酶。然而人们近几年不断发现好氧条件下总氮的损失，目前对好氧反硝化现象形成原因尚无定论，但由于好氧反硝化较传统生物脱氮技术存在着明显的优势，近年来好氧反硝化技术成为了国内外废水生物脱氮新的发展方向。好氧反硝化应用的主体是好氧反硝化菌群，目前已发现的好氧反硝化菌主要集中在假单胞菌属(Pseudomonas)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、副球菌属(Paracoccus)和芽孢杆菌属(Bacillus)，菌种应用最多，其次为机理研究，好氧反硝化菌剂利用的的报道则较少。 

发明内容

针对冬季污水处理总N不易达标，处理周期长、费用高的问题，本专利从自然界筛选出低温好氧条件下可显著提高生物脱氮效率的菌株Pseudomonas psychrophilia Den-05，并将其制成生物菌制剂，对低温条件下城市污水达标排放提供新的实现思路，对提高污水厂运行效率、降低成本有着明显的实际应用价值。 

本发明提供的菌株为Pseudomonas psychrophilia Den-05，于2012年03月27日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号CGMCC NO. 5942。 

菌株耐冷假单胞菌Den-05（Pseudomonas psychrophilia Den-05）是从哈尔滨市信义沟城市污水厂好氧池活性污泥中分离得到，好氧反硝化菌群的驯化过程均在10 ℃条件下进行。首先取15mL活性污泥和若干玻璃珠至已灭菌好的好氧反硝化液体培养基中，摇瓶培养4~5d。灭菌条件为121 ℃，高压蒸汽灭菌20分钟。第一个培养周期结束后，将获得的驯化菌液按15%的接种量加入到新鲜的好氧反硝化液体培养基中继续摇瓶培养4~5d，重复上述操作3~4次。将此混合菌液涂布在好氧反硝化固体培养基上，反复进行平板划线，固体、液体交替培养，分离出一株高效低温下进行好氧反硝化的菌株Pseudomonas psychrophilia Den-05。 

具体筛选步骤如下： 

（1）取15mL哈尔滨市信义沟城市污水厂里的新鲜活性污泥加入100mL好氧反硝化培养基三角瓶中，置于温度为10^oC，转速为150r/min的摇床中培养4~5d，获得富集菌液；

（2）取15mL富集菌液加入100mL好氧反硝化培养基三角瓶中，重复步骤（1）的培养条件3~4次，获得驯化菌液；

（3）梯度稀释驯化菌液，稀释梯度分别为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6，分别取100μL驯化菌液加入固体好氧反硝化培养基平板中，涂布法涂匀，置于温度为10℃的培养箱中，培养3~4d，获得单菌落；

（4）利用之字划线、三区划线继续纯化所获得单菌落，好氧反硝化培养基（液体）、固体好氧反硝化培养基交替培养驯化，加速筛菌过程，重复多次操作获得纯菌落；