[发明专利]一株耐冷假单胞菌Den-05及其筛选方法和应用

权利要求书

1.一株耐冷假单胞菌Den-05，其特征在于菌株为Pseudomonas psychrophilia Den-05，于2012年03月27日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号CGMCC NO. 5942。

2.根据权利要求1所述低温好氧反硝化细菌的筛选方法，其特征在于筛选步骤为：

（1）取15mL哈尔滨市信义沟城市污水厂里的新鲜活性污泥加入100mL好氧反硝化培养基三角瓶中，置于温度为10^oC，转速为150r/min的摇床中培养4~5d，获得富集菌液；

（2）取15mL富集菌液加入100mL好氧反硝化培养基三角瓶中，重复步骤（1）的培养条件3~4次，获得驯化菌液；

（3）梯度稀释驯化菌液，稀释梯度分别为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6，分别取100μL驯化菌液加入固体好氧反硝化培养基平板中，涂布法涂匀，置于温度为10℃的培养箱中，培养3~4d，获得单菌落；

（4）利用之字划线、三区划线继续纯化所获得单菌落，好氧反硝化培养基（液体）、固体好氧反硝化培养基交替培养驯化，加速筛菌过程，重复多次操作获得纯菌落；

其中好氧反硝化培养基的组成是：7.9 g Na₂HPO₄·7H₂O、0.3 g NH₄Cl、4.7 g柠檬酸钠、1.5 g KH₂PO₄、0.1 g MgSO₄·7H₂O、1.5 g KNO₃、1mL 微量元素液溶于1000 mL蒸馏水中，调节pH 7.2；固体好氧反硝化培养基在好氧反硝化培养基中另加有18g 琼脂；

微量元素的组成是：0.1 g CuSO₄·5H₂O、 0.3 g MnSO₄·4H₂O、0.2 g ZnSO₄·7H₂O、 2.0 g NaHCO₃·10H₂O、 0.5 g CoCl₂·6H₂O、 0.05g CaCl₂·2H₂O、0.5g FeSO₄·7H₂O、 0.02g (NH₄)₆Mo₇O₂·4H₂O溶于1000mL的蒸馏水中。

3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于步骤（2）中获得的驯化菌液OD₆₆₀为1.0。

4.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于培养基均在121℃下灭菌20 min后使用。

5.根据权利要求1所述的低温好氧反硝化细菌，其特征在于菌株Pseudomonas psychrophilia Den-05在低温条件下对硝酸盐具有降解能力，应用在冬季低温、好氧条件下的城市污水处理中。