[发明专利]肠道病毒71型胶体金检测试纸条及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于病原生物学检测技术领域，具体涉及一种肠道病毒71型抗原检测试纸条及其制备方法和应用。

背景技术

手足口病是全球性传染病，近年来已经成为严重威胁儿童健康的传染病之一。其以发热和手、足、咽等部位的皮疹或疱疹为主要特征。少数患者可并发无菌性脑膜炎、脑炎、急性弛缓性麻痹、呼吸道感染和心肌炎等，个别重症患儿病情进展快，易发生死亡，重症患儿病死率在10%-25%。

手足口病主要由肠道病毒属的柯萨奇病毒(Cox，A组16、4、5、7、9、10型，B组2、5、13型)、埃可病毒(Echo)和肠道病毒71型(EV71)引起，其中以EV71及CoxA16型最常见。而EV71感染引起重症病例的比例较大。

肠道病毒呈球形，呈二十面体立体外观，无包膜，直径27～30nm。衣壳由60个相同壳粒组成，它们排列为12个五聚体。每个壳粒由来自一个原始壳粒蛋白VP0的4种多肽(VP1、VP2、VP3、VP4)组成。VP1、VP2、VP3暴露于外面，带有中和抗体的特异性抗原位点，VP4位于衣壳内部。肠道病毒基因组为单股正链RNA，长7.2～8.5kb。基因组两端为保守的非编码区，中间为连续的开放读码框架，编码一个2100～2400氨基酸的多聚蛋白。功能蛋白至少包括RNA聚合酶和两种其他的蛋白酶。此外，5^‘端共价结合一个约23氨基酸的基本蛋白VPg，与病毒RNA的合成和装配有关；3^‘端带有约50 nt的polyA尾，与病毒的感染性有关。VP1蛋白是病毒中和决定因子，直接决定病毒的抗原性，具有与病毒血清型完全对应的遗传多样性及较大的变异性，为EV71基因分型的最重要对象，VP1蛋白是最适合建立ELISA方法的抗原。

由于针对EV71引起疾病的疫苗、特异性治疗药物等防控手段尚在研制中，因此，对手足口病病毒尤其是EV71引起的重症患病儿童的早期诊断，可以更经济准确的控制该病流行及重症并发症的出现，从而保证儿童的健康。

中国医学科学院医学生物学研究所公开了“EV71型病毒抗原的检测方法”专利（申请号200910094972.0），该专利是采用酶联免疫的方法来检测EV71抗原。北京科兴生物制品有限公司公开了“EV71病毒中和表位抗原检测试剂盒或试剂及其制备方法”专利（申请号200910131382.0），该专利提供了一种采用具有光谱性活性的HD6单克隆抗体对EV71 病毒抗原进行定量检测的方法。以上均是采用酶联免疫的方法来检测EV71抗原，适用于临床诊断，由于检测时间较长且需要借助专业仪器设备，不适合作早期大规模筛查用。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测肠道病毒71型的快速检测试纸条，用于检测肠道病毒71型的辅助诊断。

本发明解决上述技术问题所采取的技术方案如下：肠道病毒71型胶体金检测试纸条，其包含有：1）包被肠道病毒71型VP1特异性抗原SP55的单克隆抗体和质控抗鼠IgG两个条带的硝酸纤维素膜；2）含有胶体金标记肠道病毒71型VP1特异性抗原SP70的单克隆抗体的玻璃纤维膜。

本发明的另一目的在于提供上述肠道病毒71型胶体金检测试纸条的制备方法，包括以下步骤。

1、两种EV71单克隆抗体的制备：用人工合成SP55和SP70两段VP1的多肽，分别免疫BALB/c小鼠，采用常规杂交瘤细胞技术制备两株杂交瘤细胞，分别进行细胞培养后收集培养液，层析纯化后浓缩并冻干，-20℃保存备用，一株用于胶体金标记蛋白的制备，另一株用于包被硝酸纤维膜。

2、抗体-胶体金结合垫的制备：采用常规柠檬酸三钠还原法制备40nm的胶体金颗粒，确定单克隆抗体胶体标记的最佳结合pH 为8.5，胶体金和抗体的配比为：4.5ug/ml胶体金，待标记蛋白最佳缓冲液选择0.005M 、pH8.2～8.5 的硼酸盐缓冲液，标记胶体金经稳定剂处理后，按每平方厘米100-150ul的量取胶体金-抗体结合物溶液，均匀吸附于玻璃纤维上，放入37℃恒温干燥箱，6h后烘干取出后于室温干燥保存。

3、半成品膜条的制备：将VP1的另一株单克隆抗体用0.005M的硼酸盐缓冲液稀释成200μg/ml，将抗鼠IgG用0.005M的硼酸盐缓冲液稀释成1.2mg/ml，将两者喷于硝酸纤维素膜上，分别形成检测线和质控线，两线之间间隔为0.6-1.0cm，干燥后于室温干燥保存。

4、检测试纸条组装：将上述制备好的抗体-胶体金结合垫、半成品膜条、样品垫、吸水垫和反应支持物PVC板组装成检测试纸条。