[发明专利]毒力减弱的NSP4突变基因、重组质粒与重组牛轮状病毒

说明书

技术领域

本发明涉及毒力减弱的NSP4突变基因、重组质粒与重组牛轮状病毒（bovine rotavirus,BRV），及其构建方法，尤其是涉及一种利用反向遗传技术（Reverse Genetics Technology）获得牛轮状病毒减毒株的方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

牛轮状病毒（BRV）属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，是非细菌性腹泻的主要病原之一。其主要感染1～7日龄的犊牛，具有流行广、发病率高、危害大等特点，现已成为一种世界性疾病。BRV感染后易引起犊牛消化道机能紊乱，可继发细菌性腹泻，进而加重病情，造成犊牛死亡率提高和康复犊牛生产性能下降，严重阻碍养牛业的持续健康发展，给养牛业造成巨大的经济损失。

轮状病毒的基因组为双股RNA，分为11个节段，基因组的节段性赋予了该病毒的高变异率，带来了众多的血清型。据研究发现在全球范围内主要的流行毒株为G6血清型，大约占55.7%，G10血清型次之。而轮状病毒（Rotavirus，RV）主要通过消化道感染，抵抗其感染的主要途径是肠道粘膜免疫。通过口服或经肠道免疫RV减毒疫苗，是阻止RV对肠道粘膜上皮细胞感染的最有效方法。早在1973年美国农业部就批准了第一支新生犊牛轮状病毒口服减毒疫苗，随后国外有不同的疫苗问世。到目前为止，国内还没有安全有效的牛轮状病毒减毒疫苗投放市场。尽管现有国外疫苗还存在一些不足之处，但为BRV的防控做出了重要贡献。已有减毒疫苗是通过传代致弱、基因重配或筛选自然弱毒等传统方式获得的，传统的方法筛选毒力致弱毒株耗时、费力、成功率低，而利用反向遗传技术拯救毒力位点变异的重组病毒，将为减毒毒株的获得提供快捷途径。

反向遗传技术是指在已知基因序列的基础上，利用现代生物理论与技术，通过改变基因序列创造突变体并研究突变所造成的表型效应的相关技术。其中，在病毒cDNA分子水平上对其进行体外人工操作，如进行基因点突变、缺失、插入、颠换、转位和互补等改造，获得病毒的感染性分子克隆这一研究策略被称为“病毒拯救”技术，其为更精细地研究病毒基因功能及研制疫苗毒种提供了技术支撑。利用反向遗传技术，科学家们已成功地拯救了流感病毒、狂犬病病毒等RNA病毒。

自上个世纪九十年代以来，学者们一直致力于建立轮状病毒（RV）的反向遗传操作系统，但由于轮状病毒（RV）为11节段的双链RNA病毒，体外合成11个片段并将其包装成完整病毒粒子非常困难，这一技术瓶颈制约了该技术的应用。直至2006年，Satoshi Komoto等尝试将体外合成的VP4基因正链RNA导入细胞，在辅助病毒作用下产生新的VP4基因突变（中和抗体识别位点变异）的重组RV，利用针对野生型的VP4中和抗体抑制辅助病毒复制的功能，富集并成功获得VP4基因变异的病毒。这是目前为止报道的轮状病毒反向遗传研究的唯一成功例子，但是由于受VP4中和抗体识别位点的限制，该技术体系不适用于拯救VP4其它位点变异及病毒其它基因变异的病毒。

研究表明，RV编码的非结构蛋白NSP4(nonstructural protein 4，NSP4)是一种肠毒素，对病毒的复制和毒力非常重要（Ball等，1996），在轮状病毒的致病中发挥重要作用。它是目前唯一能引起Ca²⁺转运的已知RV蛋白，通过调控胞内Ca²⁺浓度，最终导致腹泻（Ruiz等，2000；Mori Y等,2002）。体外合成的NSP4蛋白及其短肽可引起动物腹泻，临床症状与完整RV强毒相似，但持续时间较短（Zhang等，2000）。人轮状病毒NSP4毒力位点有不同的报道，例如，55-72位氨基酸区可能是毒素功能的关键区（Ewton等，2001），82-169位的不同氨基酸变异后对NSP4的毒力影响很大（Zhang等1998；Pager等，2000）。目前，被普遍接受的人的RV NSP4毒力位点主要是114-135位氨基酸残基。如何通过改变NSP4基因的毒力位点来获得致弱毒株是目前研究的热点问题之一。

NSP4蛋白属于非结构蛋白，不能通过中和抗体方法富集变异的病毒。本研究利用RNA干扰技术（RNA interference，RNAi）解决了NSP4毒力位点变异的BRV的筛选和富集的问题。RNA干扰是指双链RNA引发的转录后基因沉默机制，它通过21~23bp的双链RNA或发夹状RNA与特异性mRNA的结合导致靶基因的降解，进而导致目的产物表达的下调。