[发明专利]毒力减弱的NSP4突变基因、重组质粒与重组牛轮状病毒

权利要求书

1.一种毒力减弱的NSP4突变基因，其特征在于：其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

2.一种包含毒力减弱的NSP4突变基因的重组质粒，其特征在于：是由毒力减弱的NSP4突变基因与空白质粒pEASY-T3连接构成的，所述毒力减弱的NSP4突变基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求2所述的重组质粒的构建方法，其特征在于：步骤如下：

（1）以常规方法构建的pEASY-T3-NSP4重组质粒为模板，分别在引物RNAi-P1、RNAi-P2和RNAi-P3、RNAi-P4的引导下，进行PCR扩增，扩增结束后，分别回收对应的PCR产物；然后将二者等量混合并作为新一轮PCR的模板，在引物RNAi-P1和RNAi-P4的引导下，做重叠PCR扩增，扩增结束后，回收PCR产物，与pEASY-T3空载体连接，获得了重组质粒AABY-1；

所述引物RNAi-P1、RNAi-P2、RNAi-P3和RNAi-P4的核苷酸序列如下：

RNAi-P1：GGCTTTTAAAAGTTCTGTTCCGAG；

RNAi-P2：GTGTGTAAAGTACTATCCATTAGAGTGATTACACTCGATG；

RNAi-P3：GATAGTACTTTACACACGATACTCGAGGATCCAGG；

RNAi-P4：GGTCACATTAAGACCGTTCCTTCCA；如SEQ ID NO.3、4、5、6所示；

（2）以重组质粒AABY-1为模板，分别在引物AABY-P1、AABY-P2和AABY-P3、AABY-P4的引导下，进行PCR扩增，分别回收对应的PCR产物；然后将二者等量混合并作为新一轮PCR的模板，在引物AABY-P1和AABY-P4的引导下，做重叠PCR，扩增结束后，回收PCR产物，与pEASY-T3空载体连接，即得到了包含毒力减弱的NSP4突变基因的重组质粒AABY；

所述引物AABY-P1、AABY-P2及AABY-P3、AABY-P4的核苷酸序列如下：

AABY-P 1：GGCTTTTAAAAGTTCTGTTCCGAG；

AABY-P2：CTACTGGGCGTGTTAACAATTTATCG；

AABY-P3：GTTAACACGCCCAGTAGACGAAATA；

AABY-P4：CACATTAAGACCGTTCCTTCCA；如SEQ ID NO.7、8、9、10所示。

4.根据权利要求3所述的重组质粒的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：

（1）以pEASY-T3-NSP4重组质粒为模板，分别在引物RNAi-P1、RNAi-P2及RNAi-P3和RNAi-P4的引导下，进行PCR扩增，反应条件为：94℃5min；94℃30s 65℃30s 72℃1min，30个循环；72℃8min；反应结束后于1%琼脂糖凝胶上电泳并回收PCR产物，作为下一次PCR反应的模板，在引物RNAi-P1和RNAi-P4的引导下，做重叠PCR，反应条件为：94℃5min；94℃30s 55℃30s 72℃1min，30个循环；72℃8min，反应产物于1%琼脂糖凝胶上电泳并回收PCR产物，与pEASY-T3空载体连接，获得了重组质粒AABY-1；

（2）以重组质粒AABY-1为模板，分别在引物AABY-P1、AABY-P2和AABY-P3、AABY-P4的引导下，进行PCR扩增，反应条件为：94℃5min；94℃30s 60℃30s 72℃1min，30个循环；72℃8min；反应结束后于1%琼脂糖凝胶上电泳并回收PCR产物，作为下一次PCR反应的模板，在引物AABY-P1和AABY-P4的引导下，做重叠PCR，反应条件为：94℃5min；94℃30s 57℃30s 72℃1min，30个循环；72℃8min，PCR产物于1%琼脂糖凝胶上电泳并被回收，与pEASY-T3空载体连接，即得到了包含毒力减弱的NSP4突变基因的重组质粒AABY。

5.一种毒力减弱的重组牛轮状病毒，其特征在于：是通过以下方法得到的：将权利要求3所述的重组质粒与常规方法构建的pcDNA3.1-T7RNAP重组质粒共转染恒河猴肾细胞MA104后，接种野生型牛轮状病毒，利用反向遗传技术拯救变异病毒，再通过RNAi技术富集和筛选得到。