[发明专利]一株可以在人肠道中定植并繁殖的益生菌及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一株可以在人肠道中定植并繁殖的益生菌及其检测方法，应用该方法对益生菌进行检测，可准确、快速的完成肠道中益生菌的定性和定量研究。 

背景技术

人类的肠道栖居着庞杂多样的微生物群落。这些微生物聚集在人类肠道内，其数量超过肠道的细胞，因此在人体肠道是一个多样性丰富动态平衡的生态系统。这个系统像是一个栖息地，一些微生物成员可以在此根深地固，一些却像是搭便车转瞬即逝。目前肠道菌群之间，及其与宿主的关系越来越引起人们的重视并成为研究热点。对其关系最常见的描述为共生（一个伙伴受益而其他的不受影响）而不是互惠（包括合作伙伴都一起受益），这对稳定这个可持续发展的肠道环境是十分关键的。研究发现，不同肠道微生物结构和组成影响着宿主的营养物质加工、能量平衡、免疫功能、胃肠道发育及其他多种重要的生理活动，进而直接影响人类健康。 

在现代分子生物学技术的帮助下，肠道微生物的研究也深入到了基因和作用机制水平。人体肠道菌群可分为硬壁菌门，拟杆菌门，放线菌门，梭杆菌门，变形菌门，疣微菌门，蓝藻菌门。这些菌门的划分都基于对最全面和多样性16SrRNA测序的研究。在所有细菌的染色体基因组中，16S rRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的rDNA序列，并具有高度的保守性和特异性。因此在生物进化的过程中16S rRNA变化级小，所以可以根据测定其序列追根溯源不同生物的亲缘关系。 

益生菌（Probiotic），源于希腊语“对生命有益”，是定植于人体肠道内，能产生确切健康功效的活的有益微生物的总称，早在上个世纪初（1907年）著名细菌学家诺贝尔奖得主梅切尼科夫即提出益生菌可以延年益寿的假说。益生菌主要包括乳杆菌（Lactobacillus）和双歧杆菌（Bifidobacterium），其益生作用主要是通过直接或者间接的调整宿主肠道微生物的组成，激活宿主内源性微生物群或者免疫系统的活性来实现的。口服益生菌能够治愈或缓解多种胃肠道或与胃肠道相关的疾病，目前研究证实口服益生菌有助于缓解乳糖不耐症，预防或者治愈胃肠炎（gastroenteritis）、抗生素相关性腹泻 （antibiotic-associateddiarrhea）、旅行性腹泻（traveler’sdiarrhea）、便秘（constipation）及肠道感染（intestinal infections），同时可抑制有害微生物在宿主肠道中定植，对肠易激综合征（irritable bowel syndrome,IBS）、炎症性肠炎（inflammatory bowel disease,IBD）及结肠癌（colon cancer）等肠道相关性疾病具有良好的预防和治疗作用。 

发明内容

本发明的目的是提供一株可以在人肠道中定植并繁殖的益生菌及其检测方法，以L.plantarum P8的全基因组序列中一段特异性片段为依据，设计了该菌株的特异性引物，使用该引物对目的菌株扩增和RT-PCR定量，可以快速准确的完成人体肠道中L.plantarum P8的定性定量研究。 

本发明的技术方案是：一株可以定植于肠道中的益生菌，其特征在于所述益生菌（Lactobacillus plantarum P8）分离自由中国境内采集的酸马奶样本，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名：植物乳杆菌，保藏号：CGMCC No.5468，保藏日期为：2011年11月18日。 

益生菌在肠道中的检测方法，其特征是包括下列步骤： 

1、粪便样品中宏基因组DNA的提取： 

采用液氮冻融—CTAB法：取1.0g粪便样品洗涤处理，将洗脱的菌体于1.5mL离心管中，立即置于液氮中完全冻结，取出后放入65℃水浴中融化（约5min），反复冻融3次，加0.1mL 10%SDS和10.0μL 10mg/mL蛋白酶K，于37℃恒温摇床中200r/min摇动2h，室温下12000g离心10min，收集上清液转移至另一离心管中。上清液与等体积的氯仿于12000g离心10min（为了使沉淀、水相和有机相分层），吸取上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿抽提2次，经0.1倍体积的醋酸钠，1倍体积的冰异丙醇沉淀总DNA，然后70%乙醇洗涤沉淀2次，回溶备用。 

2．L.plantarum P8的特异性片段的扩增 

扩增引物： 

以L.plantarum P8的全基因组序列为依据，采用本实验室自主设计的引物前序列，