[发明专利]一株可以在人肠道中定植并繁殖的益生菌及其检测方法

权利要求书

1.一株可以定植于肠道中的益生菌，其特征在于所述益生菌（Lactobacillusplantarum P8）分离自由中国境内采集的酸马奶样本，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号：CGMCC No.5468，保藏日期为：2011年11月18日。

2.可以定植于肠道益生菌在肠道中的检测方法，其特征是包括下列步骤：

（1）粪便样品中宏基因组DNA的提取

采用液氮冻融—CTAB法：取1.0g粪便样品洗涤处理，将洗脱的菌体于1.5mL离心管中，立即置于液氮中完全冻结，取出后放入65℃水浴中融化（约5min），反复冻融3次，加0.1mL 10%SDS和10.0μL 10mg/mL蛋白酶K，于37℃恒温摇床中200r/min摇动2h，室温下12000g离心10min，收集上清液转移至另一离心管中。上清液与等体积的氯仿于12000g离心10min（为了使沉淀、水相和有机相分层），吸取上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿抽提2次，经0.1倍体积的醋酸钠，1倍体积的冰异丙醇沉淀总DNA，然后70%乙醇洗涤沉淀2次，回溶备用。

（2）L.plantarum P8的特异性片段的扩增

扩增引物：以L.plantarum P8的全基因组序列为依据，引物前序列及扩增片段的具体信息为：

ATCGGTTAGGGCGTGCGCCGAGCGGAAATTATCAATGGCTTACGATGGTCAGTAGTAGCGGACGCATTAGGGTTGCCCGCGGAAAATCGTCAACGGGGAACTTATCCGTTAATTACGGAAATGGTCGCAAGTGACTTTTGGAAACAGCCAGCAGGGAGCTGGTCTGATGACACATCGATGAGTTTAGGATTGATTGAGAATTTGGTTAGCGGTGGTGATTATGATGATCTCATATGCGCTTTGGAACGAACACGC

扩增体系：反应体系50μL：10×PCR Buffer 5μL，25mmo1/L Mg²⁺1.0μL，2.5mmol/L dNTPs 4μL，5mmol/L上下游引物各2μL，DNA模板100ng左右，5U/μL Taq酶(Promega)0.5uL，dd H₂O补足至50μL；

扩增条件：95℃变性5min；循环30次：95℃变性1min，62℃退火45s，72℃延伸1min，然后72℃延伸7min，4℃保存。

（3）琼脂糖凝胶电泳：将PCR产物于1%琼脂糖凝胶中以5V/cm的电压，电泳20-30min，EB染色，紫外拍照，检测扩增效果；

（4）RT-PCR检测样品中L.plantarum P8的数量：

首先应用已知数量的L.casei Zhang通过RT-PCR扩增制作标准曲线，然后以标准曲线为依据，用上述特异性引物定量检测样品中L.casei Zhang的数量；

RT-PCR扩增体系：反应体系20μL：10×PCR mix 10μL，10mmol/L上下游引物各0.4μL，DNA模板100ng左右，dd H₂O补足至20μL。

RT-PCR扩增条件：95℃变性20s；循环40次：95℃变性5s，62℃退火30s，72℃延伸45s。

（5）肠道中益生菌L.plantarum P8定植能力的检测

随机选取33名近三个月内无抗生素类药物摄入的志愿者（性别比例17∶16），每日服用含益生菌Lactobacillus plantarum P8的片剂（活菌数>2x10¹⁰个/粒）3粒，连续服用28天，分别于0天，14天，28天以及停止服用菌片后一周即第35天，两周即第42天和四周即第56天采集志愿者粪便样品；样品采集后迅速放入液氮中速冻，并在8小时内完成粪便样品宏基因组DNA的提取；而后应用Lactobacillus plantarum P8的特异性引物进行RT-PCR扩增，检测不同时间内各志愿者体内Lactobacillus plantarum P8的残留量，进而判断其定植能力。