[发明专利]一种构建组织工程血管的方法

说明书

技术领域

本发明涉及组织工程技术领域，具体地说，是一种血管脱细胞基质膜片的制备方法，及基于该方法的构建组织工程血管的方法。

背景技术

血管疾病是我国目前死亡率最高疾病之一，血管移植是其主要的外科治疗手段。血管移植手术中需要利用组织工程血管来替代病患血管。组织工程血管是利用组织工程学方法，用血管种子细胞（内皮细胞、平滑肌细胞）与相关细胞外基质（支架材料）复合，以构建从形态到功能都接近活体血管的组织工程化血管。

血管组织支架是活细胞在体外生长所需的支持物，提供一个供种子细胞生长的三维空间，便于细胞黏着、生长和新陈代谢。支架材料除了应具有良好的生物相容性、血液相容性、无免疫原性和一定的可塑性、抗张强度和弹性，还应有适合细胞迁移和增殖的多孔结构、与细胞长入和基质分泌相当的生物降解速度、有利于细胞贴附和增殖的表面化学特性。

目前常用的支架材料有天然材料、人工合成材料和复合材料。应用于组织工程血管研究的天然材料包括甲壳素、葡聚糖明胶、胶原蛋白、弹性蛋白、多聚氨基酸、多肽、透明质酸及其复合物、某些组织的脱细胞基质等。天然材料支架本身包含许多生物信息，能够提供细胞所需的信号，且与细胞亲和性强，能为细胞提供近似体内的发生发育的细胞外基质支架条件，能使细胞聚集成组织，控制组织结构，调节细胞表型，并具有极低的免疫排斥反应和良好的顺应性，是构建组织工程血管的良好载体。现在应用较多的脱细胞血管基质材料均富含胶原，保持着胶原纤维、弹性蛋白等结构蛋白的构象和原有的排列分布，力学特性及强度与脱细胞前相似。

中国期刊《中国修复重建外科杂志》，2003年第17卷第2期，刊出的论文“脱细胞基质与血管内皮细胞体外相容性的研究”，公开了一种利用0.1%胰蛋白酶、0.02%乙二胺四乙酸钠和1.0% Triton X-100对猪主动脉作用24小时和176小时进行脱细胞，结果证明酶-化学除垢剂的脱细胞方法几乎使细胞完全脱落，且基质纤维的三维结构变得疏松，体外空增的异体猪序贯内皮细胞可以种植在脱细胞基质上并且具有伸展和增殖功能。但实际上该方法还存在以下缺陷：（1）采用完整的猪主动脉置入脱细胞溶液中，势必导致脱细胞溶液与猪主动脉不能充分接触，脱细胞效率低，进而影响移植后近、远期的血管通畅率；（2）只能构建特定直径（与原猪主动脉直径相同）的脱细胞基质及组织工程血管，仍未解决临床上常用的小口径血管移植物来源有限的问题。因此，亟需一种脱细胞化程度高的脱细胞基质的制备方法，及可构建任意口径组织工程血管的方法，但是目前关于这类方法还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种血管脱细胞基质膜片的制备方法。

本发明的再一的目的是，提供一种构建组织工程血管的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种血管脱细胞基质膜片的制备方法，所述的方法是沿血管纵轴剪开血管，剔除外膜及刮除内皮层，切成长方形血管块，沿血管块所在平面切成长方形薄片，脱细胞后冻干。

所述的血管取自成年猪主动脉弓及升主动脉。

所述的长方形血管块长15mm，宽10mm。

所述的长方形薄片的厚度是20μm。

所述的脱细胞是采用质量分数1%的SDS溶液脱细胞。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一种构建组织工程血管的方法，它包括下列步骤：

a）按照如上所述的方法制备血管脱细胞基质膜片；

b）培养血管平滑肌细胞；

c）三明治法构建组织工程血管：胰蛋白酶消化步骤b）获得的平滑肌细胞，将步骤a）的血管脱细胞基质膜片和消化后的平滑肌细胞按照“膜片－细胞悬液－膜片－细胞悬液”的方式在硅胶管上层层叠加，置入含低糖DMEM和FBS的培养液中培养。

所述的平滑肌细胞是人平滑肌细胞。

所述的硅胶管外直径为6mm，所述的细胞悬液每滴加5μl则所述的膜片环绕叠加20层。

所述的组织工程血管是在含5% CO₂ 的37℃培养箱中培养，隔两天半量换液（即隔两天倒出一半培养液，并补充进去相同体积的新鲜培养液），培养1周。

本发明优点在于：

1、本发明的构建组织工程血管的方法通过切片方法可制备得到充分脱细胞的血管脱细胞基质膜片，该膜片更有利于细胞的迁移和增殖，是一种良好的支架材料，同时切片方法可构建任意口径的组织工程血管，从而解决了临床上特定口径血管来源有限的问题；