[发明专利]一种牛乳铁蛋白肽毕赤酵母工程菌的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说是一种牛乳铁蛋白肽毕赤酵母工程菌的制备方法及应用。 

背景技术

抗菌肽是基因编码的肽类抗菌分子，是生物机体在抵御病原微生物的防御反应中所产生的一类抗微生物和一些恶性细胞的短肽。由于这类多肽具有广谱高效杀菌活性，因而最初被命名为“antibacterial peptides，ABP”，译为抗菌肽。它们不仅对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有较强的杀灭作用，对某些真菌、原生动物，尤其是对耐药性细菌也具有杀灭作用，极有可能成为一种高效、低毒且无残留危害的抗菌、抗病毒、抗癌新药，甚至可以通过基因工程的方法将抗菌肽基因导入植物、动物和微生物体内，用于大批量生产或进行动植物的抗病育种。 

1972年，瑞典科学家Boman等首先在果蝇中发现抗菌肽及其免疫功能。Steiner等人于1981年研究了来自天蚕蛹的抗菌多肽cecropins，该肽在昆虫天然免疫中发挥着重要的作用，它也被认为是第1个真正意义上的抗菌肽。随后，人们又在细菌、真菌、两栖类、哺乳动物、植物和人类中相继发现并分离得到了抗菌肽。 

牛乳铁蛋白肽(Bovine Lactoferricin，简写为Lfcin B)是经胃蛋白酶从牛乳铁蛋白(bLF)N-端(17～41)水解的25个氨基酸残基，分子量约为3.1kd。Lfcin是bLF的抗菌活性中心，对bLF抗菌活性起重要的作用(Kanget al，1996)。而Lfcin B是所有Lfcin中活性最高的，抑菌效果是牛乳铁蛋白400倍，能在胃肠道中发挥更重要的作用。在水溶液中呈亲水脂的两个反向β折叠结构，具有耐热、在消化道不易被降解、无抗原性的特征，能调节免疫作用，具有广谱抗菌作用，不干扰肠道有益菌等特性。其对许多G+和G.均有抗菌作用，如大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌等，但不作用于双歧杆菌等对人体有益细菌、同时还能刺激细胞的生长、参与免疫调节。由于其特殊的功能作用，作为饲料添加剂以及食品防腐剂的研究开发，已经受到国内外研究机构和制造商的重视，成为研究热点。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的抗菌肽LFB和编码该蛋白的基因Lfcin B。 

本发明的另一个目的在于提供该抗菌肽制品的生产方法。 

本发明的进一步目的在于提供该抗菌肽在饲料添加剂中的应用。 

牛乳铁蛋白肽(Lfcin B)是抗菌肽中的一个重要成员，它是由牛乳铁蛋白在酸性环境下经胃蛋白酶作用从N端释放的一段由25个氨基酸残基组成的小肽。研究发现，Lfcin B具有广谱抗细菌、抗真菌、抗病毒和抗肿瘤等多种生物学活性，Lfcin B独特的生物学活性使其成为一种理想的新型抗微生物药物开发的靶蛋白。 

Lfcin B的二级结构是在一级结构的肽链上折叠而成，Schibi等(1999)通过核磁共振技术对Lfcin B的活性中心的结构进行研究发现，Lfcin B是两性分子结构，碱性的Arg残基和疏水的Trp残基充分分离形成了两性分子结构，Arg残基在分子的一侧，Trp残基在分子的另一侧，Gln在分子的中间。Hwang等 (1998)研究了Lfcin B溶液的三维结构，利用核磁共振(NMR)的X衍射分析发现，Lfcin B的空间构象为扭曲的反向平行的β-折叠。这种结构与Lfcin B的抗菌和抗病毒功能分不开。 

抗菌肽LFB还具有良好的热稳定性，特别是在酸性条件下，加热甚至是高温高压处理对其抗菌活性没有影响，因此不仅能够耐受饲料加工过程中高温高压的剧烈条件，并且可以在饲料保存过程中持续发挥其功能，保持饲料品质，延长贮存期限。抗菌肽LFB做为新一代的绿色饲料添加剂，是很好的传统抗生素替代品，能有效地解决人和动物药残和病原菌耐药性的问题。 

附图说明

图1：合成抗菌肽基因Lfcin B流程图。 

图2：质粒载体pPIC3.5K的物理图谱。 

图3：pPIC3.5K-Lfcin B重组质粒载体的PCR鉴定，图中：M为DNA MarkerDL2000； 

1为以空载体pPIC3.5K质粒为模板的扩增产物；2、3、4、5为pPIC3.5K-Lfcin B转化子的扩增产物。 

图4：重组酵母转化子的PCR鉴定，M为DNA Marker DL2000；1为阴性对照；2、3、4、5、6、7为酵母重组菌株的菌落PCR扩增产物。 

图5：抗菌肽基因酵母重组载体构建的流程图。