[发明专利]一种提高丹参毛状根中丹参酮类活性成分产量的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种提高丹参毛状根中丹参酮类活性成分产量的方法。

背景技术

丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是我国一种传统中草药，因根赤色得名，始载于《神农本草经》，列为上品，能活血化瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈，现代临床上常用于心血管疾病的治疗，具有极高的药用价值。丹参的主要药用活性成分为水溶性的酚酸类化合物和脂溶性的丹参酮类化合物，其中丹酚酸B (≥3.0%) 和丹参酮IIA (≥0.2%)是《中国药典》规定的指标成分。丹参的这二类化合物都具有抗氧化、抗凝血、抗血栓、抗肿瘤、抗HIV、抗过敏、抗炎、以及扩张冠状动脉等生物活性活性。现代医学研究表明不同结构丹参酮类成分生物活性存在差异：丹参酮I能提高学习和记忆能力，丹参酮IIA则具有抗增生的活性，并能缓解骨吸收疾病的症状；二氢丹参酮I和隐丹参酮这两种具有二氢呋喃环的丹参酮具有抗菌、抗过敏效果。此外，作为二萜醌类色素的丹参酮类成分在植物天然色素开发领域受到了额外的关注。

应对目前丹参野生资源日益匮乏，栽培品种的药材质量差别大、品质严重退化、生长周期长等种种困境，生物工程技术或植物组织培养技术为丹参次生代谢物的获取提供了一种优良的替代生产体系，其中利用发根农杆菌 (Agrobacterium rhizogenes) 感染丹参获得转化毛状根的技术使工业化生产丹参药用有效活性成分成为可能。毛状根培养系统具有激素自主、遗传稳定、生长快速等优势，较之植物细胞更适合工业规模的生产。通常毛状根能够稳定合成母体植物中绝大多数次生代谢物，甚至还有可能形成一些新的化合物。但转化过程中Ri基因插入宿主基因组中位置的随机性和拷贝数的不确定性导致不同毛状根株系间的产物性质及生长速度等生理特征存在差异。在研究初期，丹参毛状根的丹参酮类含量仅为干重的0.036%-0.068%，远小于生药中0.15%丹参酮的含量。采用生物或非生物诱导子诱导提高丹参毛状根活性成分的产量是行之有效的方法，迄今为此，已报道利用酵母提取物、茉莉酸甲脂、山梨酸、银离子(Ag⁺)等作为诱导子诱导提高丹参毛状根中丹参酮类成分产量的方法，但未见采用脱落酸(abscisic acid, ABA)为诱导子诱导提高丹参酮类成分产量的研究。

本发明将脱落酸(abscisic acid, ABA)加入到丹参毛状根悬浮培养体系中诱导提高丹参酮类成分，并对其最适浓度与最佳处理时间获进行了优化，为提高丹参毛状根丹参酮产量提供了新的途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种工艺简单、成本低廉的显著提高丹参毛状根中丹参酮类成分产量的方法。

本发明的另一个目的在于提供由本发明利用丹参毛状根生产的丹参酮类活性成分，并提供这些成分在制备丹参总酮提取物、丹参酮IIa和隐丹参酮单体成份，以及在丹参酮类药物制剂方面的应用。

本发明的再一个目的在于提供利用丹参毛状根生产的丹参酮类作为天然色素，在食品、药品以及化妆品领域的应用。

本发明提供的提高丹参毛状根中丹参酮类成分产量的方法，是采用脱落酸处理悬浮培养的丹参毛状根提高丹参酮类成分产量，具体步骤为：将在6,7-V固体培养基上培养3-4周获得的丹参毛状根种株接种到Gamborg B5液体培养基中，20-30℃黑暗培养箱中用100-300 rpm水平振荡培养15-30天，然后转移到含有脱落酸的Gamborg B5液体培养基中培养1-9天；所述脱落酸的浓度为1-100 μmol/L。

本发明中，所用丹参毛状根是利用发根农杆菌C58C1诱导丹参无菌苗外植体产生丹参毛状根株系Sm031103。

本发明中，所述脱落酸的处理浓度优选为1-25μmol/L。

本发明中，所述丹参酮类成分包括丹参酮IIA、二氢丹参酮I、丹参酮I和隐丹参酮。

本发明采用脱落酸处理丹参毛状根，显著诱导和提高了丹参酮类成分的含量。实验证明，采用浓度为1-100 μmol/L的脱落酸处理丹参毛状根1-9天丹参毛状根中总丹参酮类成分的含量可提高2-6 倍。经本方法优化后的最佳脱落酸效应浓度为1-25μmol/L（约0.26-7.5 mg/L）。本发明成本低廉，操作简便，为利用丹参毛状根培养体系生产丹参药用活性成分提供了一个稳定、高效的途径。

本发明的具体操作步骤如下：