[发明专利]THP蛋白单克隆抗体的制备方法

说明书

技术领域：

本发明涉及医疗领域，特别涉及免疫学领域，具体涉及THP蛋白单克隆抗体的制备。

背景技术：

THP蛋白是一种糖蛋白，在尿中含量非常丰富，同时也是尿管型的主要组成成分，它由肾髓袢升支厚壁段及远曲小管上皮细胞合成与分泌。1950年Tamm及Horsfall利用盐析法将其分离纯化，故又称Tamm-Horsfall蛋白，正常人每日THP的排泄量为20～200mg。现已证明肾小球来源的红细胞在通过肾小管髓袢时，红细胞表面可附着THP，因此，通过特异性检测尿红细胞表面的THP蛋白有助于判定血尿来源。此外，通过检测血清及尿液中THP蛋白量的改变，可提示多种疾病的发生与发展。肾病(慢性肾病，肾功能不全，尿毒症)患者由于其肾组织受到不同病因及不同程度的损害，THP的合成减少，致使尿液和血液中THP含量下降，与尿素氮、肌酐的增高成正比。在尿路梗阻、肾移植排异反应及肾炎等疾病中均发现THP在肾间质中沉积，这是由于THP从梗阻或肾小管损伤导致的裂隙中漏出所致。另外，THP蛋白存在于泌尿系结石的核心，对结石的发生、发展起着不可忽视的作用。张卫苏等纯化尿中THP蛋白作为免疫原制备THP的单克隆抗体，但由于尿液成分复杂，纯化比较困难，现有进口商品化THP单克隆抗体，但由于价格异常昂贵，不适用于科研工作和临床使用。本研究构建了人THP蛋白367-431aa片段的表达载体，367-431aa片段是THP蛋白中优势抗原决定簌位点片段，用基因重组的方法在大肠杆菌内进行高效表达，纯化获得表达蛋白。在设计表达系统时，在表达的重组蛋白N端带有6个组氨酸标签，便于目的蛋白的纯化。通过基因工程获得的抗原蛋白具有纯度高、性质稳定、便于多次大量生产等优点。另外，大肠杆菌表达系统是目前应用最广泛的表达系统，具有外源表达水平高，操作简单，结果稳定的优点。为了进一步研究THP的结构功能和临床应用，我们表达纯化了具有免疫原性的THP蛋白的片段，免疫小鼠制备了高滴度的THP单克隆抗体，经鉴定后具有很好的免疫学功能，为科研实验和临床诊断试剂盒的研发奠定了基础。

发明内容：

本发明涉及一种THP蛋白单克隆抗体的制备方法，该方法包括以下步骤：

步骤1，THP蛋白片段THPP的制备；

步骤2，用THPP免疫小鼠；

步骤3，筛选杂交瘤细胞株；

步骤4；抗体制备。

其中，步骤1，THP蛋白片段THPP的制备；方法如下：

1)合成引物：在上、下游引物分别引入BamH1、NotI酶切位点。

367-431aa-上游引物：具体序列如下：

5’AATGGGTCGCGGATCCTCGGGCTTCAATGACAGAGACAACC3’

367-431aa-下游引物：具体序列如下：

5’TGCTCGAGTGCGGCCGCCATGTCCAGGGGGTAGGAGCAT3’

2)提取人正常肾组织mRNA，并以其为模板进行反转录PCR，合成cDNA第一链，然后以此为模板，进行PCR扩增，

3)扩增的PCR产物经纯化后，将PCR产物367-431aa DNA目的片段经BamH1与NotI双酶切，并与同样双酶切、线性化的pET28a在T DNA连接酶的作用下进行连接，

4)连接产物转化入感受态菌BL21，挑选阳性克隆，提取质粒，双酶切鉴定后测序。将测序正确的克隆抽提质粒，并转入BL21菌株，IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳监测目的蛋白的表达。表达的目的蛋白经Ni柱纯化后，得到具有免疫原性的目的蛋白THPP。

步骤2，用THPP免疫小鼠；方法如下：

THPP为免疫原免疫6周龄的雌性Balb/c小鼠；

步骤3，筛选杂交瘤细胞株；方法如下：

对抗血清效价高的小鼠，进行一次冲击免疫，阳性细胞株经过稀释克隆优化筛选出稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。

步骤4；抗体制备；方法如下：

取Balb/c小鼠，腹腔接种杂交瘤细胞，7～10天后采集腹水，将腹水样品上柱，洗脱，收集洗脱峰，经纯化得到抗体。

特别优选的，本发明的方法如下：

步骤1，THP蛋白片段THPP的制备；方法如下：

合成引物，在上、下游引物分别引入BamH1、NotI酶切位点，具体序列如下：

367-431aa-上游引物：

5’AATGGGTCGCGGATCCTCGGGCTTCAATGACAGAGACAACC3’

367-431aa-下游引物：