[发明专利]THP蛋白单克隆抗体的制备方法

权利要求书

1.一种THP蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

步骤1，THP蛋白片段THPP的制备；

步骤2，用THPP免疫小鼠；

步骤3，筛选杂交瘤细胞株；

步骤4；抗体制备。

2.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，其中，步骤1，THP蛋白片段THPP的制备；方法如下：

1)合成引物：在上、下游引物分别引入BamH1、NotI酶切位点；

367-431aa-上游引物：具体序列如下：

5’AATGGGTCGCGGATCCTCGGGCTTCAATGACAGAGACAACC3’

367-431aa-下游引物：具体序列如下：

5’TGCTCGAGTGCGGCCGCCATGTCCAGGGGGTAGGAGCAT3’

2)提取人正常肾组织mRNA，并以其为模板进行反转录PCR，合成cDNA第一链，然后以此为模板，进行PCR扩增，

3)扩增的PCR产物经纯化后，将PCR产物367-431aa DNA目的片段经BamH1与NotI双酶切，并与同样双酶切、线性化的pET28a在T DNA连接酶的作用下进行连接，

4)连接产物转化入感受态菌BL21，挑选阳性克隆，提取质粒，双酶切鉴定后测序。将测序正确的克隆抽提质粒，并转入BL21菌株，IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳监测目的蛋白的表达；表达的目的蛋白经Ni柱纯化后，得到具有免疫原性的目的蛋白THPP。

3.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，其中，

步骤2，用THPP免疫小鼠；方法如下：

THPP为免疫原免疫6周龄的雌性Balb/c小鼠。

4.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，其中，步骤3，筛选杂交瘤细胞株；方法如下：

对抗血清效价高的小鼠，进行一次冲击免疫，阳性细胞株经过稀释克隆优化筛选出稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。

5.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，其中，步骤4；抗体制备；方法如下：

取Balb/c小鼠，腹腔接种杂交瘤细胞，7～10天后采集腹水，将腹水样品上柱，洗脱，收集洗脱峰，经纯化得到抗体。

6.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，其中，步骤1，THP蛋白片段THPP的制备；方法如下：

1)合成引物：在上、下游引物分别引入BamH1、NotI酶切位点；

367-431aa-上游引物：具体序列如下：

5’AATGGGTCGCGGATCCTCGGGCTTCAATGACAGAGACAACC3’

367-431aa-下游引物：具体序列如下：

5’TGCTCGAGTGCGGCCGCCATGTCCAGGGGGTAGGAGCAT3’

2)提取人正常肾组织mRNA，并以其为模板进行反转录PCR，合成cDNA第一链，然后以此为模板，进行PCR扩增，

3)扩增的PCR产物经纯化后，将PCR产物367-431aa DNA目的片段经BamH1与NotI双酶切，并与同样双酶切、线性化的pET28a在T DNA连接酶的作用下进行连接，

4)连接产物转化入感受态菌BL21，挑选阳性克隆，提取质粒，双酶切鉴定后测序。将测序正确的克隆抽提质粒，并转入BL21菌株，IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳监测目的蛋白的表达；表达的目的蛋白经Ni柱纯化后，得到具有免疫原性的目的蛋白THPP；

步骤2，用THPP免疫小鼠；方法如下：

THPP为免疫原免疫6周龄的雌性Balb/c小鼠；

步骤3，筛选杂交瘤细胞株；方法如下：

对抗血清效价高的小鼠，进行一次冲击免疫，阳性细胞株经过稀释克隆优化筛选出稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株；

步骤4；抗体制备；方法如下：

取Balb/c小鼠，腹腔接种杂交瘤细胞，7～10天后采集腹水，将腹水样品上柱，洗脱，收集洗脱峰，经纯化得到抗体。