[发明专利]糖尿病视网膜病变相关基因多态性检测试剂盒及其制备与用途

说明书

技术领域

本发明涉及糖尿病视网膜病变早期诊断和临床预后评价中相关基因多态性的检测试剂盒，以及该试剂盒制备和在糖尿病视网膜病变早期诊断和临床预后评价中的用途。本发明涉及的糖尿病视网膜病变相关的23个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点，23个SNP位点突变或其中几个突变可诊断糖尿病视网膜病变以及评价该患者的临床预后状况。 

背景技术

目前，糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最常见和最严重的微血管并发症之一，也是一种世界范围内主要的致盲性眼病，是遗传因素与环境因素共同作用的结果。目前仅能通过询问临床病史、观察患者是否具有典型的DR临床表现确诊。对于临床表型不典型的DR、潜在DR的糖尿病患者，以及发病初期的DR患者，由于缺乏基础临床表现而难以在做出准确诊断。 

糖尿病视网膜病变是一个多基因、多阶段疾病，其发病机制复杂，目前公认的学说有：醛糖还原酶途径、非酶性糖基化作用、蛋白激酶C激活、血管舒张性前列腺素产物、视网膜生长因子产生、视网膜毛细血管血流改变等，整个病理过程涉及代谢酶、炎症、细胞因子、信号转导及离子通道等相关基因的变化[Radha V，Rema M，Mohan V，et al.Genes and diabetic retinopathy.Indian J Ophthalmol 2002；50(1)：5-11.]。基因多态性是指人类基因组中同一位置的基因或DNA序列具有不同类型，在人群中具有一定的分布频率。在基因组中，不同个体DNA序列上的单个碱基的差异称为单核苷酸多态性。近年来，随着基因多态性与糖尿病视网膜病变关系的研究不断深入和扩展，已经筛选出可能与之相关的数十种基因。 

目前，还没有专门针对糖尿病视网膜病变相关基因进行检测的成熟产品和 方法。本发明针对世界范围内已报道的糖尿病视网膜病变相关基因多态性，发明了检测糖尿病视网膜病变23个相关基因多态性的试剂盒产品及其制备方法，其中分别为脂肪炎症因子的6个SNP位点、血管紧张素II 1型受体相关受体的5个SNP位点以及血管内皮生长因子A的12个SNP位点，可以快速、有效、准确、经济地检测出23个糖尿病视网膜病变相关基因多态性位点，为糖尿病视网膜病变的早期诊断和临床预后提供有价值的指导。 

发明内容

糖尿病视网膜病变是个多基因疾病，整个发病过程中涉及代谢酶、炎症、细胞因子、信号转导及离子通道等相关基因的变化，这些遗传基因多态性与DR的发病和发展密切相关。本发明遴选出与糖尿病视网膜病变密切相关的23个关键的单核苷酸多态性位点，其中分别为脂肪炎症因子的6个SNP位点、血管紧张素II 1型受体相关受体的5个SNP位点以及血管内皮生长因子A的12个SNP位点，通过提取基因组DNA并进行聚合酶链式反应(PCR)及测序检测SNP位点突变状况，早期诊断和临床预后评价糖尿病视网膜病变。 

本发明涉及一种快速检测糖尿病视网膜病变相关基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括与糖尿病视网膜病变相关的23个单核苷酸多态性位点多重PCR预扩增引物和单碱基延伸引物。 

本发明涉及快速检测糖尿病视网膜病变相关基因多态性的试剂盒，包括与糖尿病视网膜病变相关的23个SNP位点多重PCR预扩增引物，其序列如下： 

本发明涉及快速检测糖尿病视网膜病变相关基因多态性的试剂盒，与糖尿病视网膜病变相关的23个SNP位点单碱基延伸引物，其序列如下： 

本发明还提供一种快速检测糖尿病视网膜病变相关基因多态性的试剂盒制备方法。该试剂盒包括：人外周血基因组DNA提取液、多重PCR预扩增反应液、阴性对照、阳性对照、多重PCR预扩增产物纯化试剂、单碱基延伸反应液和单碱基延伸产物纯化试剂； 

其中，人外周血基因组DNA提取液包括：去离子水，6M NaI，氯仿/异戊醇混合液，异丙醇和无水乙醇； 

多重PCR预扩增反应液包括：10×PCR缓冲液，2U-5U的Taq酶，0.2～1.0mM的dNTPs，如上所述的1-11SNP位点的多重PCR预扩增引物混合物，以及如上所述的12-23SNP位点的多重PCR预扩增引物混合物，该两种预扩增引物混合物的用量分别都为0.2μmol； 

阴性对照为去离子水； 

阳性对照为已知基因型人基因组DNA样品；