[发明专利]糖尿病视网膜病变相关基因多态性检测试剂盒及其制备与用途

权利要求书

1.一种快速检测糖尿病视网膜病变相关基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括与糖尿病视网膜病变相关的23个SNP位点多重PCR预扩增引物和单碱基延伸引物；其中，所述的与糖尿病视网膜病变相关的23个SNP位点多重PCR预扩增引物的序列如下：

所述的与糖尿病视网膜病变相关的23个SNP位点单碱基延伸引物的序列如下：

。

2.一种快速检测糖尿病视网膜病变相关基因多态性的试剂盒，其特征在于，其包括：人外周血基因组DNA提取液、多重PCR预扩增反应液、阴性对照、阳性对照、预扩增产物纯化试剂、PCR产物单碱基延伸反应液和延伸产物纯化试剂；

其中，人外周血基因组DNA提取液包括：去离子水，6M NaI，氯仿/异戊醇混合液，异丙醇和无水乙醇；

PCR预扩增反应液包括：10×PCR缓冲液，2U-5U的Taq酶，0.2～1.0mM的dNTPs，权利要求1所述的1-11SNP位点的预扩增引物混合物，以及权利要求1所述的12-23SNP位点的预扩增引物混合物，该两种预扩增引物混合物的用量分别都为0.2μmol；

阴性对照为去离子水；

阳性对照为已知基因型人基因组DNA样品；

预扩增产物纯化试剂为虾碱性磷酸酶SAP和核酸外切酶ExoI；

PCR产物单碱基延伸反应液包括：5μl预反应混合液、权利要求1所述的1-11SNP位点的预扩增引物相对应的的11个延伸引物，与权利要求1所述的12-23SNP位点的预扩增引物相对应的的11个延伸引物混合物，上述两种延伸引物混合物的用量分别都为0.2μmol；

延伸产物纯化试剂为6μl的碱性磷酸酶CIP。

3.一种如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，其使用步骤如下：

步骤一，糖尿病视网膜病变患者外周血样本23个SNP位点PCR预扩增

取来自糖尿病视网膜病变患者外周血10ml，按外周血基因组DNA抽提纯化的方法抽提患者外周血中基因组DNA，取2μl用1×TAE缓冲液加热溶解的1％琼脂糖凝胶进行电泳，检测DNA质量，所述百分比为m/v；

获取的糖尿病视网膜病变患者外周血样本基因组DNA模板后，提取的基因组DNA为多重PCR预扩增模板，进行PCR预扩增，目的富集延伸模板； 

PCR预扩增反应条件如下：

1)PCR反应体系如下：

针对与糖尿病视网膜病变密切相关的23个SNP位点分两个预扩增反应体系，其中一个使用如权力要求1所述的1-11SNP位点的上游和下游多重PCR预扩增引物，另一个使用如权力要求1所述的12-23SNP位点的上游和下游多重PCR预扩增引物；DNA为上述获得基因组DNA模板。

2)将配制好的体系放入PTC-100PCR仪中，应用扩增程序如下：95℃，5分钟；94℃，30秒；60℃，30秒；72℃，30秒；共32个循环；72℃，8分钟；

3)预扩增产物质检：取2μlPCR预扩增产物上样，取用1×TAE缓冲液加热溶解的1％琼脂糖凝胶电泳，检测DR外周血样本PCR预扩增23个SNP位点的扩增情况，所述百分比为m/v；

预扩增产物纯化：每个糖尿病视网膜病变外周血样本取每个预扩增产物3μl，用去离子水稀释到15μl混匀；取该混合产物用于纯化；纯化程序如下：37℃，1小时；75℃，15分钟；消化体系如下：

步骤二，糖尿病视网膜病变患者外周血样本23个SNP位点基因测序取上述经纯化的PCR预扩增产物，进行单碱基延伸反应，延伸反应体系如 下：

1)延伸体系：

针对与糖尿病视网膜病变密切相关的23个SNP位点分两个单碱基延伸反应体系，其中一个使用如权利要求1所述的1-11SNP位点多重PCR预扩增引物相对应的11个单碱基延伸引物，另一个使用如权力要求1所述的12-23SNP位点多重PCR预扩增引物相对应的12个单碱基延伸引物；

2)将配制好的延伸反应体系放入PTC-100PCR仪中，延伸条件：96℃，10秒；50℃，5秒；60℃，30秒；共27个循环；

3)延伸产物纯化：6μl延伸反应产物加入0.5个活性单位CIP；纯化条件：37℃，1.0小时；75℃，15分钟；

4)向96孔板中每孔加入分子量内标和甲酰胺混合液9μl，单碱基延伸产物1.0μl，该分子量内标和甲酰胺混合液中两者的体积比为0.5∶8.5；

5)96孔板放置PTC-100PCR仪中95℃变性3分钟，上3730XL测序仪进行检测；

6)数据分析：将检测得到的原始数据文件导入到分析软件中进行分析。