[发明专利]利用人工microRNA提高水稻抗黑条矮缩病的方法及其专用双链RNA

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高水稻抗黑条矮缩病的方法及其专用双链RNA，尤其涉及利用人工microRNA技术及其双链专用RNA，属于生物技术领域。 

背景技术

水稻是我国的第一大粮食作物，水稻的生产对于保障我国粮食安全具有重要的战略意义。虽然我国经过长期努力，利用传统育种技术在提高水稻的产量和品质方面取得了巨大的进步，但是水稻的病虫害仍未得到有效的控制。特别是近年来水稻黑条矮缩病毒的发生对我国的水稻生产造成了巨大的损失。 

水稻黑条矮缩病是由水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarfviral diease,RBSDV）引起的，RBSDV病毒属于呼肠孤病毒科斐济病毒属，是一种主要由灰飞虱传播的病毒病，其危害性大。除危害水稻外,该病毒还危害大小麦、玉米、高粱及马唐、稗草等禾本科作物和杂草（章松柏等，2010）。水稻黑条矮缩病作为一种病毒病，现在没有有效药物治疗，而且水稻以及其它作物中缺少对黑条矮缩病毒的抗原，这使得传统育种很难获得抗RBSDV的种质。 

近年来，水稻黑条矮缩病毒基因组的研究已经取得了丰硕的成果。研究表明RBSDV的基因组由10条双链RNA组成，按其在聚丙烯酰胺上迁移距离由小到大计的顺序依次命名为：S1-S10（王朝辉2004，方守国2000，张恒木2001）。RBSDV的基因组大小为29141nt，是目前斐济病毒属中基因组最大的一个。RBSDV的S1-S6均编码病毒的一个主要蛋白，其中S1可能编码RNA依赖的RNA聚合酶；S2长约3813nt，编码一个有1226个氨基酸组成的蛋白，猜测很可能是核心结构蛋白；S3长3752nt，编码一个有1146个氨基酸组成的蛋白，其编码蛋白可能是病毒粒子的结构蛋白；S4、S5长3617nt、3163nt，功能未知；S6长2645nt，虽然功能未知但利用计算机软件对其二级结构的预测和数据库比较分析表明，其编码蛋白存在高度保守的亲水性结构域及多个跨膜区域，可能具有结合RNA及ATPase活性，这些结果表明，RBSDV的S6基因可能具有编码植物基因沉默抑制子的功能；S7全长大约为2193nt，含有两个开发阅读框（ORF），分别编码约为41Ku和36Ku的蛋白质ORF1和ORF2，目前已经正式ORF1和ORF2均为病毒的非结构蛋白；S8全序列约为1936bp，只含有1个ORF，编码蛋白的分子量约为68Ku，可能是病毒的核心衣壳蛋白；S9全长1900bp，含有2个ORF，其中ORF2保守性极高，编码一种24.2Ku的非结构蛋白。S10全长1819nt，编码病毒63ku的外壳蛋白。截止到2010年6月29日在NCBI注册的RBSDV序列总计有60条，其中20 条是从中国水稻、玉米产区分类得到的。RBSDV基因组序列测序及其功能研究的深入，为利用植物基因工程提高水稻抗矮缩病的能力，培养抗病新种质奠定了基础。 

相比传统杂交育种，利用基因工程技术手段培育抗病品种是彻底解决水稻黑条矮缩病毒的根本途径，而且与药剂防治相比，它既不用增加生产投资，也没有农药残留污染环境，对防治发生范围广、流行速度快的病害更为有效。 

人工microRNA（Artifical microRNA，amiRNA）技术是利用内源microRNA前体骨架，通过替换microRNA序列产生具有新功能的microRNA。最近人工microRNA在抗病育种的潜力逐渐被人们认识，Schwab等利用拟南芥pre-miRNA172和pre-miRNA319做骨架，将miRNA/miRNA*区替换成与目标mRNA互补的片段，形成了artifical microRNA，在拟南芥中超表达后引起表型的明显改变（Schwab 2006），证明amiRNA可以有效沉默单个和多个靶基因，并且在诱导性启动子或组织特异性启动子驱动下均可以特异性地发挥作用；Warthmann等利用水稻osa-MIR528作骨架构建了人工microRNA，成功对水稻靶基因高效干涉（Warthmann）。2006年Niu等通过修饰拟南芥miR159的前体获得了能够分别镖靶P69和HC-Pro的人造microRNAs amiR-P69159和amiR-HC-Pro159，发现表达amiR-P69159和amiR-HC-Pro159的转基因拟南芥能够分别特异抵抗TYMV和TuMV病毒感染（Niu，2006）。2007年Qu等设计了镖靶黄瓜花叶病毒（CMV）的沉默抑制子2b的microRNA并在烟草中表达，获得抗病毒的烟草植株，并且发现烟草的抗性水平和microRNA的表达水平成正相关（Qu，2007）。