[发明专利]一种畜禽原代肝细胞分离、培养与鉴定的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种适用于畜禽各类动物的畜禽原代肝细胞分离、培养与鉴定的方法。

背景技术

肝脏是机体发挥代谢功能，去氧化，储存肝糖，合成分泌性蛋白质和生物转化等多种生物学功能的重要器官，也是药物发挥毒性作用的主要场所。因此，许多的离体研究都选用畜禽原代肝细胞为生物材料，如肝细胞生理功能调节、代谢性疾病，药理学、病理学和毒理学机制，病毒感染细胞模型的建立，以及理化和毒物因素的影响等领域。

可见，原代肝细胞的分离、培养与鉴定是完成以上体外研究的首要环节，而肝细胞在体外能否无血清培养成功，其分离与培养方法至关重要。近年来，国内外许多学者在原代肝细胞分离和培养技术上做了大量的探索，在肝细胞分离、培养技术的实际应用方面取得了不少成果。早期主要采用非酶法分离肝细胞，包括机械分离法及螯合法。机械分离法是利用机械剪切、增压过筛及强力吹打等物理手段来分离肝细胞的方法，对肝细胞损伤大，细胞活率低。螯合法是用可结合Ca²⁺、Mg²⁺的螯合剂(如EDTA)去除Ca²⁺依赖性黏附因子，使细胞间桥粒断裂而分离肝细胞，但螯合剂单独使用效果不好，常需与酶法结合使用。后期逐渐改为酶消化法分离肝细胞，包括胶原酶消化法与胰蛋白酶消化法等。酶消化法是利用酶来破坏肝细胞之间的桥连，使肝细胞分离的一种方法。酶消化法的通常做法是，将组织剪碎后加入适量浓度的消化酶，放入37℃水浴摇床消化适当时间。但是，对于肝脏来说，采用组织块消化法通常分离得到的细胞活性较低，而且肝组织块内大量红细胞很难去除。进行酶消化法时，对酶的浓度及其作用时间要求十分严格，尤其是胰蛋白酶为一种强蛋白质消化酶，对肝细胞膜损伤严重，易造成肝细胞死亡。1972年，Seglen首次采用原位两步胶原酶灌流法分离大鼠肝细胞成功取得高活率，因为采用胶原酶消化法分离原代肝细胞，对肝细胞损伤较小，且肝细胞膜在消化过程中所受到损害可在培养后得到修复。此后，众多研究者对该方法进行了一定改进，并用于不同物种肝细胞的分离。如Fraslin等改良原位两步灌流法用于成年鸡肝细胞的分离；Douaire等以Williams’ medium E作为基础培养液建立成年鸡肝细胞无血清培养体系；中国专利申请(200410084625.7)报道了一种生物人工肝用猪和人肝细胞的制备方法；中国专利申请(200610050853.1)用Dispase-胶原酶灌流法获高活率的新鲜原代猪肝细胞等。但以上分离方法均一定的局限性，主要表现为：一方面是原代肝细胞得率与纯度不高，活力不强，过程较繁琐；另一方面为有血清培养体系，无法为部分肝功能研究提供生物学材料。

发明内容

为克服现有技术的上述缺点，本发明提供一种能有效提高分离到的原代畜禽肝细胞数量、活率和纯度, 所获得的原代肝细胞损伤少、易贴壁和活性好的畜禽原代肝细胞分离、培养与鉴定的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方法是：一种畜禽原代肝细胞分离、培养与鉴定的方法，将螯合法与原位两步灌流法进行整合，预先脱去畜禽肝脏组织内Ca²⁺与Mg²⁺，使之尽量多地释放出原代肝细胞，通过调整培养液的添加物配方，完善其无血清培养体系，并就所获原代肝细胞进行糖原鉴定。

它的操作步骤是：

一、畜禽原代肝细胞的分离

 畜禽手术前禁食，自由饮水过夜，颈部注射1400IU/kg剂量肝素钠抗凝，腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉动物；

 将麻醉后的畜禽仰卧位保定在小动物手术台上，该手术台放在大瓷盘上，用75%酒精擦拭全身，转入超净工作台内；

 无菌条件下打开腹腔，轻轻把肠道拉向躯体右侧，暴露肠系膜静脉，结扎下腔静脉两端，并在其中汇入肝门静脉方向插管，然后松开流向肝脏的一端；

 进行灌流分离，首先进行消化前灌流，又分为两部分：第一部分以50ml/min的速率灌注37℃预热的灌流液，该灌流液中含有10mM HEPES、137mM NaCl、3mM KCl、3mM Na₂HPO₄.12H₂O和5mM EDTA，待肝脏稍鼓胀时剪开上腔静脉，持续20min，然后以同样速率灌注37℃预热的灌流液，该灌流液中含10mM HEPES、137mM NaCl、3mM KCl和3mM Na₂HPO₄.12H₂O，持续5min；