[发明专利]一种畜禽原代肝细胞分离、培养与鉴定的方法

权利要求书

1.一种畜禽原代肝细胞分离、培养与鉴定的方法，其特征在于将螯合法与原位两步灌流法进行整合，预先脱去畜禽肝脏组织内Ca²⁺与Mg²⁺，使之尽量多地释放出原代肝细胞，通过调整培养液的添加物配方，完善其无血清培养体系，并就所获原代肝细胞进行糖原鉴定。

2.如权利要求1所述畜禽原代肝细胞分离、培养与鉴定的方法，其特征在于操作步骤是：

一、畜禽原代肝细胞的分离

 畜禽手术前禁食，自由饮水过夜，颈部注射1400IU/kg剂量肝素钠抗凝，腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉动物；

 将麻醉后的畜禽仰卧位保定在小动物手术台上，该手术台放在大瓷盘上，用75%酒精擦拭全身，转入超净工作台内；

 无菌条件下打开腹腔，轻轻把肠道拉向躯体右侧，暴露肠系膜静脉，结扎下腔静脉两端，并在其中汇入肝门静脉方向插管，然后松开流向肝脏的一端；

 进行灌流分离，首先进行消化前灌流，又分为两部分：第一部分以50ml/min的速率灌注37℃预热的灌流液，该灌流液中含有10mM HEPES、137mM NaCl、3mM KCl、3mM Na₂HPO₄.12H₂O和5mM EDTA，待肝脏稍鼓胀时剪开上腔静脉，持续20min，然后以同样速率灌注37℃预热的灌流液，该灌流液中含10mM HEPES、137mM NaCl、3mM KCl和3mM Na₂HPO₄.12H₂O，持续5min；

 待流出的液体变清后，进行第二步消化灌流，即以20ml/min速率灌入37℃预热的灌流液，该灌流液中含有10mM HEPES、137mM NaCl、3mM KCl、3mM Na₂HPO₄.12H₂O、5mM EDTA、5.4mM CaCl₂和0.4g/L 型胶原酶，并用止血钳适当夹住已剪开的后腔静脉，使灌流液缓慢流出，15min后肝脏逐渐被消化；

 触动肝脏表面呈现组织比较松软后，开始将其摘取并放入一无菌平皿中，加入50ml预冷的威廉斯(氏)介质E（ Williams’ medium E）基础培养液，剔除血管、脂肪和结缔组织，剪去肝脏周边消化不完全的部分；

 用镊子撕掉肝脏包膜，剪碎肝组织，大口径吸管轻轻吹打，随后分别过100目(150μm)、200目(75μm)及400目(30μm)细胞筛，所得肝细胞悬液用威廉斯(氏)介质E（ Williams’ medium E）基础培养液清洗2次，再在4℃ 500rpm离心5min；

 用贴壁培养液，该贴壁培养液中含有体积百分比为10%的新生牛血清、10^-6 M人胰岛素、10^-6 M地塞米松、10 μg/ml人转铁蛋白、10 μg/ml Vit C、双抗(100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素，Gibco公司)的基础培养液)重悬、台盼蓝拒染法检测细胞活率、血细胞计数板计数；

二、畜禽肝原代细胞的培养

细胞计数后，用贴壁培养液将细胞悬液稀释为2～5×10⁵ cell/ml，在直径为60ml的培养瓶中接种15ml ，接种密度为1×10⁵ cell /cm²，在37℃、5% CO₂和饱和湿度的条件下培养，4h细胞贴壁后，用生长培养液全量换液，该生长培养液中含体积百分比为10%的新生牛血清及双抗的基础培养液继续培养20h，此后，用无血清培养液、10μg/ml维生素C、0.15% BSA和双抗的Williams’ medium E基础培养液)全量换液，该无血清培养液中含5×10^-7 M地塞米松、1×SITE (这是(insulin, transferrin, selenium, ethanolamine) 的缩写，也可写成ITES，Sigma-Aldrich公司，含10μg/ml牛胰岛素、5.5μg/ml人转铁蛋白、2.9×10^-8M亚硒酸钠、2μg/ml乙醇胺)，以后每24h更换培养液，倒置显微镜下观察肝细胞形态及生长情况；

三、畜禽原代肝细胞的糖原鉴定

取上述无血清培养液培养48 h（接种后第3 d）的肝细胞进行糖原染色鉴定，具体操作步骤如下：

 吸去培养液，加入Carnoy’s液室温固定细胞15 min后弃液，加入95%酒精，5 min；

 弃液，加入70%酒精15 min后弃液，加入质量百分比为0.8%的过碘酸酒精溶液氧化，10 min；

 蒸馏水洗2 min后，加入Schiff’s酒精混合液，10 min；

 弃液后，加入0.5%偏亚硫酸钠溶液，2 min后蒸馏水再洗2 min；

 加入Ehrlich’s苏木精复染细胞核，20 min；

 以0.5%盐酸酒精分色，自来水蓝化10 min；

 95%酒精及100%酒精分别脱水2 min；

 二甲苯透明，树胶封片，倒置显微镜下观察。