[发明专利]八角基因组DNA的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种顽拗类植物基因组DNA的提取方法，具体涉及八角基因组DNA的提取方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

顽拗类植物（Recalcitrant plant taxa）是指那些由于特殊细胞结构和高含量次生产物而使得基因组DNA的提取非常困难的一类植物。这些次生产物主要包括多糖、多酚、蛋白质以及其他一些未知的粘性极强的化合物。提取DNA时，它们通常与核基因组DNA共同沉淀或者捆绑在一起，严重地影响了DNA质量，导致扩增、酶切等分子操作难以进行。有许多林木树种属于这一类植物，八角便是其中的一种。

八角（Illicium verum Hook. f.）为八角科（Illiciaceae）八角属（Illicium Linn.）植物，常绿乔木，是我国南亚热带地区特有的一种经济价值很高的香料树种，也是著名的“药食同源”的树种之一。八角叶片中含有丰富的多糖、蛋白质、莽草酸、维生素等次生物，这让它具有了较高的利用价值，但同时给其基因组DNA的提取也带来了较大的困难。采用分子标记技术进行八角种质资源遗传多样性研究，揭示其遗传多样性水平和遗传结构状况，对于高效地建立八角种质资源基因库、八角遗传育种以及八角种质的进一步开发利用具有非常重要的指导意义。

基因组DNA的提取是分子生物学研究的基础，常用的基因组DNA提取方法有：CTAB法、改良CTAB法、SDS法、高盐沉淀法、试剂盒等。采用上述几种方法提取八角基因组DNA时都出现研磨样加入提取液后变得非常粘稠，提取的DNA样品由于含有大量的次生物不易溶于TE缓冲液，缠搅在其中的粘性物致使DNA检测时上样困难、电泳困难。凝胶电泳检测显示DNA得率很低，上样孔或样道非常亮（见图1～4）。

发明内容

为了解决八角次生物含量高导致的高质量DNA提取困难的问题，本发明对常用的CTAB方法加以改良，同时结合试剂盒提取的某些步骤，获得了一种八角基因组DNA提取的有效方法。

本发明通过下列技术方案实现：一种八角基因组DNA的提取方法，其特征在于经过下列各步骤：

（1）按每100 g八角粉末加入6～8 L提取液的量，在八角粉末中加入55～65℃的CTAB提取液，混匀，在55～65℃下保温30～60分钟，其间晃动3～4次，使其充分混合，得混合物；

（2）将步骤（1）的混合物在转速为8000～12000 rpm下，离心分离5～10分钟，得到上清液A；

（3）在步骤（2）所得上清液A中加入等体积的氯仿与异戊醇溶液，其中，氯仿︰异戊醇的体积比为24︰1，混匀后在室温下静置5～10分钟，再在8000～12000 rpm下离心分离5～10分钟，取出上清液；在上清液中再次加入等体积的体积比为24︰1的氯仿与异戊醇溶液，混匀后室温静置5～10分钟，离心分离，得到上清液B；

（4）按上清液B体积的2～3倍的量，在上清液B中，加入-30 ℃的无水乙醇，产生絮状沉淀，离心得沉淀物；

（5）采用植物DNA提取试剂盒的吸附柱将步骤（4）所得沉淀物，按试剂盒程序进行漂洗、室温静置、离心洗脱，得洗脱液；

（6）将步骤（5）所得的洗脱液返回到吸附柱中，室温下静置5～10分钟，再在8000～12000 rpm下离心分离2分钟，所得的液体即为八角基因组DNA溶液。

所述步骤（1）的八角粉末是：在八角叶片或者枝条或者果实或者其它部位中（干样），按常规加入液氮研磨成的粉末。

所述步骤（1）的CTAB提取液为：母液是含有1.4 mol/L的NaCI、100 mmol/L的Tris-HCI、20 mmol/L的EDTA的混合溶液，母液的pH为8.0，常规灭菌；使用时在每100ml母液中加入3g的CTAB，2g的PVP和2ml的β-巯基乙醇。

上述母液（200 mL）的配制是先称取16.363g NaCI、2.428g Tris-base、1.489g EDTA，再用HCl调pH为8.0，然后定容至200 mL。

所述步骤（5）的试剂盒为北京索莱宝科技有限公司生产的Solarbio植物基因组DNA提取试剂盒。

所述步骤（5）使用吸附柱时，若出现黄绿色，需加入无水乙醇600 uL后，再离心分离。

本发明具有下列优点和效果：