[发明专利]一种采用固定化菌株高效生产L-山梨糖的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种固定化G.oxydans高效生产L-山梨糖的方法，特别是利用海藻酸钠作为固定化载体包埋G.oxydans，并在发酵过程中以油酸作为氧载体提高溶氧，以实现菌体的重复利用、连续的生产操作、方便的分离纯化，从而提高生产强度和产品质量稳定性、降低生产成本。

背景技术

L-山梨糖，一种己酮糖，为D-果糖的C-2位和C-3位差向异构体。是工业发酵生产维生素C(VC)的中间体，目前工业上主要用“莱氏法”和“两步发酵法”生产VC，二法初始均经发酵将D-山梨醇转化为L-山梨糖。其中，以D-山梨醇为底物的发酵工艺是唯一用于工业生产的方法。

目前国内外L-山梨糖的发酵方式都是游离细胞批式生产工艺，生产成本相对较高，由于固定化细胞具有细胞密度大、反应速度快、重复利用率高、能实现连续操作、耐毒害能力强、产物品质稳定且易于分离纯化等优点，成为了许多实验室研究的热点，已见报道的有采用PVA、海藻酸钙、聚丙烯酰胺固定化的微生物细胞转化D-山梨醇成为L-山梨糖，但均未大规模生产。其主要困难是好氧菌活细胞的固定化方法和氧的传递较难，固定化细胞机械强度较低。鉴于此，一种成本低廉、固定化凝珠机械强度好、发酵过程中保证溶氧充足的固定化方法应该是在发酵法生产山梨糖工艺中降低成本的有效策略。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种固定化G.oxydans ATCC 9937发酵生产L-山梨糖的方法，通过选择合适的固定化载体，保持细胞的活性，同时增加其重复利用率，发酵过程中选择添加适当的氧载体，解决固定化细胞的传氧限制，实现生产山梨糖工艺的高强度、低成本要求。

以下是本发明技术方案的详细描述。

固定化载体浓度的选择与固定化细胞的制备

根据海藻酸钠可在CaCl₂溶液中钙化凝固的原理，采用电子蠕动泵将海藻酸钠与G.oxydans的混合溶液泵入CaCl₂中，形成直径为2mm-3mm的固定化细胞颗粒，4°C静置2h，使颗粒稳定成型，再用无菌水洗涤2次，即得固定化细胞。

将采用不同浓度的海藻酸钠制备的固定化细胞在增殖培养基中增殖24h后接入发酵培养基，采用摇瓶发酵，每隔3-4h取样检测山梨醇的转化率，得到最佳的海藻酸钠浓度为2%。

利用2%的海藻酸钠固定化细胞，通过不同直径的蠕动泵泵管制备不同直径的固定化凝珠，增殖后进行发酵，得到最佳的固定化凝珠直径为2mm。

氧载体的选择与浓度确定

将正己烷、正十六烷、油酸三种氧载体加入发酵培养基后，利用海藻酸钠浓度为2%，直径为2mm的固定化细胞进行发酵，得到相同发酵时间内能使山梨醇转化率最高的氧载体为油酸。再通过油酸的添加浓度优化得到最佳的添加浓度为4%(v/v)。用所得最佳条件进行发酵，42h内山梨糖的产量达到133g/L，比游离菌发酵缩短了6h。

固定化细胞的增殖培养与发酵

增殖培养基：山梨醇150g，酵母膏6g，CaCO₃ 2g，pH4.8～5.1，自来水定容至1L。

发酵培养基：山梨醇150g，酵母膏2g，CaCO₃ 2g，pH4.8～5.1，自来水定容至1L。

增殖培养基和发酵培养基的灭菌温度为115-121°C，15min。海藻酸钠灭菌温度为110°C，20min。油酸等氧载体经0.22μm膜过滤除菌，接种前加入。

15mL种子液制备的固定化凝珠接入增殖培养基，500mL锥形瓶中种子培养基为50mL，温度为30°C，转速200rpm，培养时间为20-24h。

将发酵培养基加入到完成增殖的固定化种子中，500mL锥形瓶中发酵培养基为50mL，同时加入2mL油酸，30°C、200rpm条件下每批培养42h。

D-山梨醇与L-山梨糖浓度的测定：高效液相色谱(HPLC)

仪器：Agilent 1100高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、示差折光检测器和工作站)。

色谱柱：Aminex HPX-87H(Bio-Rad)；

流动相：0.005mol/L H₂SO₄；

流速：0.6mL/min；

柱温：35°C；

进样量：5μL；

检测器为示差折光检测器。