[发明专利]尿肌氨酸及肌酐测定试剂盒无效
申请号: | 201210145532.5 | 申请日: | 2012-05-11 |
公开(公告)号: | CN102680599A | 公开(公告)日: | 2012-09-19 |
发明(设计)人: | 章开程;叶军;胡英伟;林益华;李军艳 | 申请(专利权)人: | 上海特敏生物医药科技有限公司 |
主分类号: | G01N30/02 | 分类号: | G01N30/02 |
代理公司: | 上海申汇专利代理有限公司 31001 | 代理人: | 俞宗耀;俞昉 |
地址: | 201108 上海市*** | 国省代码: | 上海;31 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 氨酸 测定 试剂盒 | ||
技术领域
本发明涉及医药检测技术领域,具体涉及尿中肌氨酸和肌酐测定试剂盒。
背景技术
通过检测生物样本中小分子或者大分子标志物是疾病筛查与诊断的有效手段,对于疾病的早期诊断、治疗和预后具有重要的参考价值和临床意义。肌氨酸(N-甲基甘氨酸, sarcosine)是一种存在于人体肌肉和其他组织的天然氨基酸,为甘氨酸的代谢产物。研究表明,肌氨酸在侵袭性前列腺癌中含量显著升高,且肌氨酸可在尿样中检测出来,这一发现使得肌氨酸成为前列腺癌非损伤性诊断的一个候选生物标记,也有可能成为更优的新型的前列腺癌进展标志物。尿中肌酐的排泄量较少受尿液浓缩和稀释的影响,故尿中肌酐浓度的测定常用作尿中其他物质排泄浓度的参照物。在本试剂盒中肌酐作为肌氨酸的参照物在同一份样品中同时测定,校正了样品中肌氨酸的浓度,降低了对临床样品的要求。目前对于肌氨酸和肌酐的检测,分别采用气相色谱-质谱法和化学法,它们的主要缺陷是特异性和灵敏度低,方法比较复杂。
液相色谱-同位素稀释质谱法,属于非损伤性检测方法,是近年来获得迅速发展的分析测试技术,在体内药物分析、临床生化和新生儿遗传性代谢疾病筛选等领域已有广泛应用。它具有高度特异性、灵敏度和准确性的特点,且成本低廉,简单、快速,已成为临床科研中检测量值的基准方法之一。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简便、专一灵敏的尿中肌氨酸浓度的定量检测法及配套试剂盒,以满足开展大规模临床前列腺癌研究的需要。
本发明公开的尿肌氨酸和肌酐测定试剂盒的组成包括:
1)对照品:肌氨酸浓度分别为100-300μg/L、1000-3000μg /L、5000-8000μg /L和肌酐浓度分别为100-300mg/L、1000-3000mg/L、5000-8000mg/L的化学品;
2)质控品:肌氨酸浓度为800-1000μg /L 和肌酐浓度为800-1000mg/L的化学品;
3)内标溶液:肌氨酸-d3 50-100mg/L,肌酐-d3 150-200 mg/L的化学品;
4)沉淀剂:乙腈;
5)流动相A:含0.1 mmol/L甲酸铵和0.4%甲酸的20%乙腈水溶液;
6)流动相B:含0.02%甲酸和20%乙腈的水溶液。
采用所述试剂盒进行尿中肌氨酸和肌酐测定方法,其特征在于步骤为:
1)标准曲线的绘制:用对照品和內标的比值绘制标准曲线,用质控品和內标的比值确认标准曲线;
2)尿样采集:随机尿,3000rpm离心5min,取上清尿2 mL左右-20℃保存,临用前于室温下解冻;
3)样品稀释处理:尿样中以乙腈∶尿样体积比为2∶1的比例加入沉淀剂乙腈,除去尿样中蛋白,并稀释尿样至肌氨酸浓度为100-5000μg/L,肌酐浓度为100-5000mg/L;
4)色谱分离纯化: 以硅胶键合相填料为色谱柱,流动相A和流动相B采用等度或者梯度洗脱,将肌氨酸和肌酐从色谱柱上洗脱,与其他干扰物质色谱分离;
5)质谱检测:经液相色谱仪分离纯化的肌氨酸和肌酐,采用电喷雾离子化串联质谱仪,在正离子检测模式下,检测肌氨酸和肌酐;肌氨酸的母离子,其质量电荷比m/z为90±0.5;经过进一步质谱碎裂后同时检测肌氨酸的母离子和碎片离子,其质量电荷比m/z分别为90±0.5和44±0.5;肌酐的母离子,其质量电荷比m/z为114±0.5;经过进一步质谱碎裂后同时检测肌酐的母离子和碎片离子,其质量电荷比m/z分别为114±0.5和86±0.5;
6)结果计算:以肌氨酸和肌酐质谱检测获得的峰面积与內标峰面积的比值,代入标准曲线回归方程,根据公式y =a+bx计算即可得到肌氨酸或肌酐的浓度值。其中,Y为肌氨酸或肌酐与內标峰面积比值,x为肌氨酸或肌酐的浓度值。
所述步骤4)中: HYPERSIL silica,5μm, 2.1×100mm,Thermo,流动相B:含0.02%甲酸的 20%乙腈溶液,等度洗脱,流速:0.3mL/min,进样量:5μL。
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