[发明专利]一种负载季铵化壳聚糖/siRNA复合粒子的皮肤再生材料及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种负载基因活性物质的皮肤再生材料及其制备方法，具体说涉及一种负载季铵化壳聚糖/siRNA复合粒子的胶原-壳聚糖/硅橡胶皮肤再生材料及其制备方法。

背景技术

皮肤是人体最大的器官，约占人体重量的16%。皮肤由表及里可依次分为表皮层、真皮层以及皮下组织三部分；其结构具有高度复杂性，包括多种细胞和胶原、弹性蛋白、糖蛋白或蛋白多糖等生物大分子，以及氨基酸、葡萄糖、维生素、无机盐等小分子。由于日常生活中大面积暴露于外部坏境中，皮肤极易因烧伤、机械创伤和慢性疾病（如糖尿病）等导致缺损，严重影响人类生命和生存质量。目前，自体皮移植仍是临床上治疗皮肤缺损的最佳方法，然而对于大面积缺损患者往往存在供皮区不足和二次甚至多次手术的问题。近年来，基于组织工程和再生医学原理的各类皮肤再生材料逐步发展起来，成为治疗皮肤缺损的有效手段。

胶原-壳聚糖/硅橡胶双层支架是一类原位诱导真皮再生的皮肤再生材料，由胶原-壳聚糖三维多孔支架和硅橡胶薄膜组成。其中胶原-壳聚糖三维多孔支架起真皮再生模板作用，可有效诱导缺损组织处细胞迁移、增殖和分化，最终实现真皮组织的再生。硅橡胶薄膜则起临时表皮层的作用，可有效防止水分丧失和抵御细菌入侵，对创面实施临时保护。该双层支架所采用原料为胶原和壳聚糖，均为生物相容性好、免疫原性低和可生物降解的材料。经证明，该皮肤再生材料可实现创伤和烧伤导致的全层皮肤缺损的修复与再生。

然而，经该材料再生修复的皮肤组织仍然存在一定的瘢痕化问题，影响了再生皮肤组织的生理功能。瘢痕化是人体创伤修复过程中应激反应的产物，其本质是细胞外基质（ECM）的合成代谢与降解代谢的失衡，进而导致细胞外基质（主要为胶原）的过量沉积。瘢痕性修复虽能恢复创面的完整性，但并不能重建皮肤原有结构和功能，易引起皮肤组织畸形和功能障碍，也可导致局部皮肤溃烂和瘙痒等问题。皮肤修复过程的瘢痕化涉及多种细胞因子的调控，其中转化生长因子β（TGF-β）是调控胶原、蛋白多糖等细胞外基质沉积，调节瘢痕形成的关键细胞因子。研究表明，适量的TGF-β有益于创面愈合，但是TGF-β，尤其是TGF-β1的过量表达却可导致瘢痕化；因此，抑制皮肤修复过程中的TGF-β1表达水平，可减少瘢痕的形成。目前，抑制TGF-β1水平的途径主要有：TGF-β1抗体中和，6-磷酸甘露糖、核心蛋白聚糖等拮抗剂的应用，可溶性TGF-β1受体竞争TGF-β1结合位点，以及反义寡核苷酸干扰TGF-β1基因表达等。小干扰RNA（siRNA）技术是近10年发展起来的一种先进基因技术，它可在转录后水平和翻译水平上阻断靶基因的表达，广泛应用于基因组学、抗肿瘤和抗病毒等领域的研究。采用siRNA技术调控TGF-β1水平，可避免TGF-β1抗体的免疫原性和易失活等问题。相对于反义寡核苷酸等其他基因调控手段，siRNA技术具有高效，特异性好以及持续时间长等优点。siRNA的作用效果极大程度依赖于其传递载体，理想的siRNA载体可起到保护siRNA免受破坏和促进siRNA被细胞摄入的作用。其中，季铵化壳聚糖具有良好的生物相容性和传递效率，是一类有效的siRNA载体材料。

siRNA与其载体形成的复合粒子，可通过简单快捷的物理吸附作用负载到胶原-壳聚糖/硅橡胶双层支架。胶原-壳聚糖/硅橡胶双层支架对siRNA起到储存和缓释的作用，最终通过siRNA在皮肤缺损创面的原位转染来下调皮肤修复过程中瘢痕化相关因子（TGF-β1或其下游信号通路因子如Smad2蛋白和Smad3蛋白）的表达水平，在有效促进缺损创面再生修复的同时，抑制胶原的过度沉积，降低再生皮肤组织的瘢痕化程度。

发明内容

本发明的目的是提供一种负载季铵化壳聚糖/siRNA复合粒子的皮肤再生材料及其制备方法，该皮肤再生材料可广泛应用于创伤和烧伤等全层皮肤缺损，在有效诱导缺损皮肤再生修复的同时抑制再生皮肤的瘢痕化。

1.       本发明提供的负载季铵化壳聚糖/siRNA复合粒子的皮肤再生材料，包括由胶原-壳聚糖三维多孔支架和硅橡胶薄膜构成的胶原-壳聚糖/硅橡胶双层支架，在双层支架中吸附有季铵化壳聚糖/siRNA复合粒子，其中，siRNA与胶原-壳聚糖/硅橡胶双层支架的质量比为1：1000—10：1000，季铵化壳聚糖/siRNA复合粒子中季铵化壳聚糖与siRNA的质量比为1:1—50:1。

上述的siRNA是抑制转化生长因子β1（TGF-β1）的siRNA、抑制Smad2蛋白的siRNA或抑制Smad3蛋白的siRNA。