[发明专利]胍基化聚乙烯醇转基因非病毒载体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种转基因载体及其制备方法，更具体地说，涉及一种改性聚乙烯醇转基因载体及其制备方法。 

背景技术

基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正、补偿基因的缺陷或异常，从而达到治疗目的的方法。通过基因治疗可以使某些通过其他手段无法治愈的疾病得到有效地治疗甚至预防。基因工程病毒最早被用作基因载体。早期研究证明了病毒载体的高效率，然而，其副作用也十分的明显。人们认识到病毒载体可能通过插入诱变引发癌症，因为基因随机嵌入寄主染色体可能会扰乱重要的正常的基因的表达。此外，基因载体本身也会引发免疫响应从而产生严重的后果。这些为题促使了人们对于更加安全的低病原性和致免疫性的非病毒基因载体的研究，这些研究包括脂质体载体，无机材料和基于高分子材料的非病毒载体。除了更加安全之外，这些非病毒载体具有更加丰富的物理化学结构来提供多样化的功能。然而非病毒载体普遍有着转染效率低的缺点。 

阳离子高聚物作为非病毒载体的一部分，它除了存在非病毒载体的特点（低毒性，低免疫原性和低致癌性）以外，还有自身的优势，即易制备和携带目的基因能力高，这些更加有利于其作为转基因载体的应用。常见的阳离子高聚物能够通过强静电作用有效缩合DNA，形成较稳定的聚电解质复合物(PECs)。这些PECs易于细胞内化，从内涵体中逃逸，并能有效保护DNA免受DNA酶的降解。但是阳离子高聚物作为基因载体应用时，仍呈现出了一些问题，例如生物相容性差、有毒性、以及转染效率低等。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种胍基化聚乙烯醇非病毒基因载体及制备方法和应用。该共聚物具有转基因的能力，实现对于DNA的运输和表达。本发明制备方法简单，合成条件温和。 

本发明的目的通过下述技术方案予以实现： 

胍基化聚乙烯醇非病毒基因载体，以聚乙烯醇为主链，具体结构如下所示： 

其中n、m、p分别为三种不同重复单元的数量，需要说明的是由于制备过程中采用聚乙烯醇为原料进行逐步的取代反应，故在每一步取代反应过程中，都会有部分乙烯醇单元发生反应，所以在确定n、m、p时可在反应结束之后通过相关测试手段予以确认（例如核磁共振）。 

胍基化聚乙烯醇非病毒基因载体的制备方法，按照下述步骤进行： 

首先，即步骤（1），将聚乙烯醇和对甲苯磺酰氯进行反应得到聚乙烯对甲苯磺酸酯，具体来说，向容器中加入聚乙烯醇（PVA）和吡啶，85℃下预反应两小时，再向该烧瓶中加入双倍体积的吡啶，反应体系降温至5℃左右；冷却后，再向容器中加入1.5倍体积的对甲苯磺酰氯，溶液变为淡黄色。反应体系在5~10℃下反应24h；结束后，向反应瓶中加入等体积丙酮，使得非均相反应体系中的不溶物充分溶解，将溶液加入约10倍体积的蒸馏水中产生白色沉淀，减压抽滤，弃掉液体；重复这一步骤，将滤得固体再次溶于丙酮并在水中沉淀，减压抽滤得到产物并进行真空干燥，即得到聚乙烯对甲苯磺酸酯； 

其次，即步骤（2），将聚乙烯对甲苯磺酸酯和过量的乙二胺反应，以得到乙二胺修饰的聚乙烯醇，具体来说，将得到的聚乙烯对甲苯磺酸酯加入容器中，加入二甲基亚砜（DMSO）使其溶解，并加入过量的乙二胺，在70℃下反应48h；冷却后，加入盐酸调节pH至中性，将反应液在去离子水中透析3天（透析袋截留分子量3500Da），每8h换一次水，冷冻干燥，得到乙二胺修饰的聚乙烯醇； 

然后，即步骤（3），将乙二胺修饰聚乙烯醇（PVA-NH₂）和1H-吡唑-1-甲咪盐酸盐 （Sigma公司）放入容器中，加入蒸馏水进行溶解，室温下进行反应，得到胍基化聚乙烯醇非病毒基因载体，具体来说，室温（20—25度）反应24h，再将反应液在去离子水中透析3天（透析袋截留分子量3500Da），每8h换一次水，冷冻干燥，得到胍基化程度不同的胍基化聚乙烯醇非病毒基因载体。 

在完成步骤（2）后，可对乙二胺修饰的聚乙烯醇进行核磁氢谱测试，通过测试结果确定乙二胺的接枝率，并根据氨基摩尔量加入不同量的1H-吡唑-1-甲咪盐酸盐进行反应，进而得到不同胍基化程度不同的胍基化聚乙烯醇非病毒基因载体。