[发明专利]一种甘蓝型油菜耐湿性改良的方法

权利要求书

1.一种甘蓝型油菜耐湿性改良的方法，其步骤是：

    A、含vgb的抗草胺磷表达载体的构建：

    （1）目的片段获得：以NCBI网站上公布的vgb序列为模板设计引物，以质粒DNA为底物进行PCR扩增；

    （2）PCR产物回收、转化及测序：回收PCR扩增片断，将片段连入Simple-T vecter中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过篮白斑筛选获得阳性单克隆，挑选阳性克隆，繁殖菌液，送样测序；

    （3）T-DNA制备：与NCBI网站上公布的vgb序列的编码区做比较，挑选没有碱基差异的阳性单克隆菌液，抽取质粒DNA，双酶切后回收酶切片段得到T-DNA；

    （4）Vector制备：繁殖菌液：包含NPTⅡ表达元件、Bar表达元件的大肠杆菌菌液，抽取质粒DNA，双酶切后回收酶切片段得到Vector；

    （5）表达载体制备：连接步骤（3）得到的T-DNA和步骤（4）得到的Vector，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单克隆，繁殖菌液，抽取质粒DNA；

    （6）农杆菌菌液制备：将步骤（5）得到的质粒DNA转化农杆菌LBA4404感受态细胞，挑取单克隆，繁殖菌液，即得到后续工作中所需要的包含NPTⅡ表达元件、Bar表达元件和vgb的农杆菌菌液；

 B、抗草胺磷耐湿甘蓝型油菜恢复系的获得：

 通过农杆菌介导法将vgb转化到R₂或R₆中得到T₀代植株；室内分子标：vhb5'/vhb3':5'GCAATCACGCCATAAGCCT3'鉴定或田间草胺磷鉴定得到阳性单株，自交得到T₁代；室内功能鉴定后得到T₁代单株，自交得到T₂代；室内分子标记鉴定或田间草胺磷鉴定获得vgb位点纯合的抗草胺磷耐湿甘蓝型油菜恢复系；

C、抗草胺磷耐湿甘蓝型油菜保持系的获得：

在农杆菌介导法转化效率足够及人手充足的情况下采用途径（a），或在途径（a）无法实施的情况下采用途径（b）：

（a）通过农杆菌介导法将vgb转化到甘蓝型油菜6098B或8908B得到T₀代植株；室内分子标记鉴定或田间草胺磷鉴定得到阳性单株，自交得到T₁代；室内功能鉴定后得到T₁代单株，自交得到T₂代；室内分子标记鉴定或田间草胺磷鉴定获得vgb位点纯合的抗草胺磷耐湿甘蓝型油菜保持系；

（b）以步骤B中得到T₁代恢复系单株为父本与6098B或8908B杂交得到F₁代，再以6098B或8908B为轮回亲本，回交至BC₃代时得到保持系遗传背景的甘蓝型油菜，田间草胺磷筛选、考察中选单株表型、室内分析中选单株遗传背景后选出单株自交并与6098A或8908A杂交，观察后代育性分离情况，结合室内品质分析结果选出vgb位点杂合的优良T₁代保持系单株；对自交得到的T₂代保持系株系进行室内分子标记鉴定或田间抗草胺磷鉴定得到vgb位点纯合的抗草胺磷耐湿甘蓝型油菜保持系；

    D、抗草胺磷耐湿甘蓝型油菜不育系的获得：

将步骤C中得到的vgb位点纯合的抗草胺磷耐湿甘蓝型油菜保持系与6098A或8908A杂交得到vgb位点纯合的抗草胺磷耐湿甘蓝型油菜不育系。