[发明专利]三种菌的三重实时荧光PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及重要的食源性致病菌沙门氏菌（Salmonella）、肠炎沙门氏菌（Salmonella Enteritidis）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）的三重实时荧光PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法。 

背景技术：

沙门氏菌（Salmonella）是重要的食源性致病菌之一，在世界各国细菌性食物中毒病例中，沙门氏菌引起的食物中毒案例常列榜首或第二位。沙门氏菌的血清型有2500多种，均有致病性，但宿主感染范围可分为宿主适应血清型和非宿主适应血清型，前者包括马流产沙门氏菌、羊流产沙门氏菌、鸡沙门氏菌等，它们只能在相适应的宿主才有致病性，然而肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸭沙门氏菌、则能使多种宿主致病。英国的一项调查表明，肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌感染占到人类沙门氏菌感染病例的75％以上。食品中沙门氏菌的检测主要是依靠传统的培养的方法（可参见国标GBT4789.4-2010），该方法需经选择性增菌培养，并通过生化反应及血清学测试来鉴定，操作复杂，费时费力，通常要5~6天才能得出检测结果，不利于及时诊断病因，查找病源，控制病情的蔓延。随着分子生物学的发展，已有针对沙门氏菌不同基因进行PCR扩增的报道，目前用作PCR试验的引物主要有编码抗原的基因和其它基因，rfbs基因（编码D群和A群的O抗原），rfbj基因（编码B群和C2群的O抗原），rbfE基因（编码伤寒菌的O抗原）；ViaB基因（编码Vi抗原）；fliC-a基因（编码H：a抗原）；fliC-d基因（编码H:d抗原）；毒力基因invA、spvC、invE等，但上述序列做目的 片段的普通PCR法或荧光PCR法，只能检测到部分沙门氏菌血清型或其毒力基因。在肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌的特异性基因检测上，Wood等用肠炎沙门氏菌特异性血清型质粒的2Kb Pst I/BgⅢDNA片段作为靶序列建立PCR检测方法，但许多肠炎沙门氏菌分离株无特异血清型质粒，该方法只能检测特异血清型的肠炎沙门氏菌；Edel O'Regan等用flic、sefa、sdf、acek为目的基因，用荧光PCR方法检测沙门氏菌，但该方法无法准确区分鼠伤寒沙门氏菌、肯塔基沙门氏菌、都柏林沙门氏菌和鸡沙门氏菌。 

发明内容：

本发明的目的是提供一种简便、快速、可靠、灵敏度高、特异性强的沙门氏菌（Sa）、肠炎沙门氏菌（SE）、鼠伤寒沙门氏菌（ST）三重实时荧光PCR检测引物、探针、检测试剂盒和检测方法，通过一次实时荧光PCR扩增就能判断样品是否受到沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌的污染。 

本发明根据沙门氏菌菌属共有的aceA基因（GenBank:U43344.1）的保守区域、肠炎沙门氏菌特异序列（GenBank:AF370707.1）的保守区域、鼠伤寒沙门氏菌的STM4599序列（GenBank:AERV01000023.1）的保守区域，分别设计检测引物和检测探针，沙门氏菌的aceA基因用于检测不同血清型沙门氏菌，肠炎沙门氏菌的特异序列用于检测肠炎沙门氏菌，鼠伤寒沙门氏菌的STM4599序列用于特异性检测鼠伤寒沙门氏菌，利用基于Taqman探针的三重实时荧光PCR方法，通过一次实时荧光PCR扩增来判断样品中是否受到沙门氏菌、肠炎沙门氏菌及鼠伤寒沙门氏菌的污染，达到简便、快速、可靠、灵敏度高和特异性强的目的，从而实现了本发明的目的。 

本发明的沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌三重实时荧光PCR检测引物，其特 征在于，所述的检测引物如下所示： 

针对aceA基因： 

5`-TCACCGAAAGACCAACAGAAG-3`；（如SEQ ID NO.1所示） 

5`-GAACTCGCTGAAATGAGCAG-3`；（如SEQ ID NO.2所示） 

针对肠炎沙门氏菌特异序列： 

5`-CTCATTCTGACCTCTAAGCCG-3`；（如SEQ ID NO.3所示） 

5`-TCTGGTACTTACGATGACAACTTC-3`；（如SEQ ID NO.4所示） 

针对鼠伤寒沙门氏菌STM4599序列： 

5`-ATTTCTGGATATGGTACTGAGGC-3`；（如SEQ ID NO.5所示） 

5`-AAATGAGTTGCTTTACGCTGC-3`。（如SEQ ID NO.6所示）