[发明专利]一种生产重组粉尘螨变应原Der f1和Der f2融合蛋白的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及生物学技术构建粉尘螨变应基因技术领域，尤其涉及一种生产重组粉尘螨变应原Der f1和Der f2融合蛋白的方法。 

背景技术：

尘螨种类繁多，广泛存在于人类生活和工作环境中，其排泄物、代谢物及螨体均具较强的变应原性，据估计，全球约10％的人口对尘螨过敏，约80％的外源性哮喘由尘螨引起，我国学者用粉尘螨粗提浸液对变态反应性疾病患者进行皮肤挑刺试验，47～92.11％的成人哮喘患者、51.64～78.85％哮喘患儿、80％左右的鼻炎患者、70％左右慢性荨麻疹患者呈阳性反应，1998年，美国由哮喘造成的直接和间接经济损失高达12.7亿美元，近年来，建筑技术的发展和人民物质生活的丰富，室内居住环境发生了很大变化，但居室温、湿度相对稳定，空调环境使空气不能直接对外流通，环境为尘螨孳生提供了适宜条件，人们在室内逗留时间延长增加了尘螨过敏原接触，尘螨相关疾病的发生率随之增加，因此，开展尘螨源变态反应性疾病的预防、诊断、治疗及其发生机理等研究不仅具有重要的社会效益。 

过敏性哮喘是由免疫系统内淋巴细胞亚群Th1/Th2比例的失衡和其它一些因素综合引起的，特异性免疫治疗被认为是目前唯一哮喘病因治疗方法，可以改变哮喘病程，能阻滞症状的恶化和防治对新的变应原产生过敏，其通过小剂量皮下注射尘螨变应原，并逐渐增加变应原剂量，提高患者对特异性变应原的免疫耐受力，调节患者细胞免疫功能，增强Th1反应、抑制Th2反应，并产生高水平的IgG抗体阻断变应原结合到IgE，目前，临床采用尘螨变应原粗提浸液免疫治疗 I型变态反应性疾病患者，由于变应原浸液包含成分较复杂如存在变应原、非过敏性或毒性蛋白及其它成分，在治疗过程中长期使用易导致红晕、肿胀、硬结、坏死等局部反应和休克、喉头水肿、支气管痉挛、荨麻疹、血管性水肿、全身性红斑等全身反应，此外，采用粗提浸液进行诊断，无法明确患者对变应原各组分的反应程度，易致误诊。 

因此，变应原的质量对变态反应疾病的诊断和治疗至关重要，用于免疫诊治的变应原应该是纯品而不宜为粗制浸液，但是，尘螨变应原主要存在于排泄物和皮壳中，采用生物化学方法提纯尘螨变应原，耗时长，过程繁琐，成本较高，且无法彻底去除溶剂等成份，不能从根本上提高变应原的纯度、避免免疫治疗中副反应的发生，随着分子生物学技术的发展和成熟，研制基因工程技术生产重组变应原成为变态反应学研究的主流，其纯度高，分类明确，可提高诊断的准确度，并有望为新型免疫治疗提供标准化制品。 

尘螨变应原组成复杂，约有30余种，其中第1组分和第2组分约占螨粗提浸液的90％；在螨过敏患者的血清中，80％以上患者的IgE结合这两类抗原，并呈现强反应性，因此诱导Th2型应答的主要是第1和2组分(Wayne R.Thomas，Wendy-Anne Smith，et al.The allergenic specificities of the house dust mite[J].Chang Gung Med J.2004；27(8)：563～569)，因此，重组粉尘螨变应原第1、2组分及二者的融合蛋白，可为临床诊治尘螨源变态反应性疾病提供制品。 

发明内容：

本发明的目的是提供一种生产重组粉尘螨变应原Der f1和Der f2融合蛋白的方法，它耗时短，过程简单，成本较低，可以彻底去除溶剂等成份，从根本上提高变应原的纯度，避免免疫治疗中副 反应的发生，其纯度高，分类明确，可提高诊断的准确度，并有望为新型免疫治疗提供标准化制品。 

为了解决背景技术所存在的问题，本发明是采用以下技术方案：它通过提取粉尘螨总RNA，根据GenBank公布的粉尘螨变应原第1组份(Der f1)和粉尘螨变应原第2组份(Der f2)核酸序列设计引物，用PCR扩增获得其编码基因，依次克隆至pMD19-T载体、亚克隆至表达载体pET-28a(+)并转化至大肠杆菌并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，以PMD 19-T-Der f1、PMD 19-T-Der f2为模板，PCR扩增后切胶、回收产物Der f1和Der f2，PCR搭链构建嵌合基因片段，切胶回收产物并命名为Der fm，克隆至pMD19-T载体、亚克隆至表达载体pET-28a(+)并转化至大肠杆菌并用IPTG诱导表达，所有表达产物经琼脂糖凝胶FF亲和柱层析纯化后，用SDS-PAGE和Western-blotting验证产物。