[发明专利]鸭瘟病毒gE基因转移载体pUC-ΔgE-EGFP及重组株DPV-ΔgE-EGFP

说明书

技术领域

本发明涉及动物医学领域中一种基因工程制品的制备方法，特别涉及鸭瘟病毒gE基因部分缺失的转移载体构建及其应用。

背景技术

鸭瘟(duck plague，DP)是由疱疹病毒科中的鸭瘟病毒(Duck plague virus，DPV)引起的常见于鸭、鹅、天鹅等雁形目水禽的一种高度致死性传染病。目前，鸭瘟仍是危害水禽养殖业持续稳定发展的重要因素，加强鸭瘟的研究对水禽养殖业的防制尤为重要。用于预防鸭瘟的疫苗主要有灭活苗和弱毒苗两大类，一般认为弱毒苗免疫效力较灭活苗好，弱毒苗虽然只使鸭体产生低水平中和抗体，当受强毒攻击时可使鸭体产生明显的血清记忆反应。

基因缺失疫苗毒株稳定，不易返祖，免疫原性好、安全性高。gE基因是非常重要的毒力基因，它的缺失使病毒的毒力大大降低，但是病毒仍可以复制，因此在疱疹病毒基因工程疫苗中gE基因缺失疫苗的研究十分关键。另一方面，重组病毒活载体疫苗兼有常规活疫苗和灭活疫苗的优点，是当前新型疫苗研制与开发的主要方向。疱疹病毒是用于活载体疫苗制备的理想病毒载体之一，作为疱疹病毒成员的鸭瘟病毒，基因组较大，约160kb左右，可容纳多个外源基因的插入。以gE基因作为一个插入位点，来表达外源基因蛋白，由于gE基因的缺失、突变，从而使该鸭瘟病毒的野毒株毒力减弱，不再引起临床疾病，但仍能感染宿主并诱发保护性免疫力，而且和外源基因蛋白的共表达，可产生多联疫苗。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种鸭瘟病毒转移载体及其构建方法，该转移载体可通过与鸭瘟病毒同源重组，获得重组鸭瘟病毒，为鸭瘟病毒gE基因缺失疫苗及其gE基因功能研究打下基础。

一种鸭瘟病毒gE基因转移载体pUC-ΔgE-EGFP，包含转移载体pUC-ΔgE-EGFP的大肠杆菌种(Escherichia coli)JM109于2012年2月24日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2012033；分类命名为大肠杆菌JM 109/pUC-ΔgE-EGFP(Escherichia coli JM109/pUC-ΔgE-EGFP)。

所述的转移载体pUC-ΔgE-EGFP的制备方法，包括以下步骤：

1)以鸭瘟病毒CHv株为材料，利用PCR扩增部分gE基因及其左侧翼(L)1073bp片段和部分gE基因及其右侧翼(R)1130bp片段，克隆进载体pMD18-T，构建质粒pMD-L和pMD-R；

2)先将pMD-L用Hind III和BamH I酶切，回收1073bp片段，克隆进已用相应限制性内切酶酶切的pUC18载体，然后再将pMD-R中的部分gE基因及其右侧翼(R)1130bp片段以BamH I和EcoR I插入到已含有部分gE基因及其左侧翼(L)的pUC-L载体中，获得载体pUC-ΔgE；

3)用ApaL I和Mlu I酶切质粒pEGFP-Cl，回收包含CMV立即早期启动子、EGFP基因、转录终止信号SV40polyA以及一个多克隆位点基因共2016bp片段的EGFP表达盒，然后对其进行补平；

4)先将载体pUC-ΔgE，用BamH I酶切后，进行补平，再将其与3)中获得补平后的EGFP表达盒连接，从而获得转移载体pUC-ΔgE-EGFP；

上述扩增PCR扩增部分gE基因及其左侧翼(L)1073bp片段的上、下游引物分别是：

上游引物：5′-AAGCTTCCTGAAAGATGTTCTAAG-3′

下游引物：5′-GGATCCTTGATGATAGTCTGCTATAC-3′

上述扩增PCR扩增部分gE基因及其右侧翼(R)1130bp片段的上、下游引物分别是：

上游引物：5′-GGATCCGTTTGTAGTCGGTCTCGG-3′

下游引物：5′-GAATTCCGTATTAACCTTTTGTAGCT-3′。

鸭瘟病毒gE缺失重组株DPV-ΔgE-EGFP，于2012年2月23日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：V201210。

所述鸭瘟病毒gE缺失重组株DPV-ΔgE-EGFP的制备方法，由以下步骤完成：

1)鸭瘟病毒CHv株感染鸭胚成纤维细胞；

2)转移载体pUC-ΔgE-EGFP质粒转染；

3)收获出现荧光斑的细胞；

4)结合无限稀释法，通过空斑纯化获得重组鸭瘟病毒。