[发明专利]鸭瘟病毒gE基因转移载体pUC-ΔgE-EGFP及重组株DPV-ΔgE-EGFP

权利要求书

1.一种鸭瘟病毒gE基因转移载体pUC-ΔgE-EGFP，包含转移载体pUC-ΔgE-EGFP的大肠杆菌种(Escherichia coli)JM109于2012年2月24日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2012033；分类命名为大肠杆菌JM109/pUC-ΔgE-EGFP(Escherichia coli JM109/pUC-ΔgE-EGFP)。

2.权利要求1所述的转移载体pUC-ΔgE-EGFP的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)以鸭瘟病毒CHv株为材料，利用PCR扩增部分gE基因及其左侧翼(L)1073bp片段和部分gE基因及其右侧翼(R)1130bp片段，克隆进载体pMD18-T，构建质粒pMD-L和pMD-R；

2)先将pMD-L用Hind III和BamH I酶切，回收1073bp片段，克隆进已用相应限制性内切酶酶切的pUC18载体，然后再将pMD-R中的部分gE基因及其右侧翼(R)1130bp片段以BamH I和EcoR I插入到已含有部分gE基因及其左侧翼(L)的pUC-L载体中，获得载体pUC-ΔgE；

3)用ApaL I和Mlu I酶切质粒pEGFP-C1，回收包含CMV立即早期启动子、EGFP基因、转录终止信号SV40polyA以及一个多克隆位点基因共2016bp片段的EGFP表达盒，然后对其进行补平；

4)先将载体pUC-ΔgE，用BamH I酶切后，进行补平，再将其与3)中获得补平后的EGFP表达盒连接，从而获得转移载体pUC-ΔgE-EGFP；

上述扩增PCR扩增部分gE基因及其左侧翼(L)1073bp片段的上、下游引物分别是：

上游引物：5′-AAGCTTCCTGAAAGATGTTCTAAG-3′

下游引物：5′-GGATCCTTGATGATAGTCTGCTATAC-3′

上述扩增PCR扩增部分gE基因及其右侧翼(R)1130bp片段的上、下游引物分别是：

上游引物：5′-GGATCCGTTTGTAGTCGGTCTCGG-3′

下游引物：5′-GAATTCCGTATTAACCTTTTGTAGCT-3′。

3.鸭瘟病毒gE缺失重组株DPV-ΔgE-EGFP，于2012年2月23日保藏于位于中国武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：V201210。

4.权利要求3所述鸭瘟病毒gE缺失重组株DPV-ΔgE-EGFP的制备方法，其特征在于，由以下步骤完成：

1)鸭瘟病毒CHv株感染鸭胚成纤维细胞；

2)转移载体pUC-ΔgE-EGFP质粒转染；

3)收获出现荧光斑的细胞；

4)结合无限稀释法，通过空斑纯化获得重组鸭瘟病毒。