[发明专利]一种用于检测PDGFRα基因突变的引物、探针及试剂盒

说明书

技术领域

血小板衍生生长因子受体（Platelet-derived Growth Factor Receptors,PDGFR）是一种调节细胞生长的跨膜蛋白,属于III型酪氨酸激酶家族，主要分布于平滑肌细胞，内皮组织细胞、成纤维细胞和胶质细胞。PDGFR由α和β两种亚型结构组成，分子量约为170-180kD,可以分为配体结合区，跨膜区、近膜区和酪氨酸激酶区四个结构功能区（Bauman et al.,Clin Cancer Res 2007,13;4632）。PDGFR在调节细胞增殖，分化和新血管形成等方面发挥重要调节作用。PDGFR通过与信号分子结合后形成受体配体复合物并活化PDGFR，进而激活磷脂酰肌醇及下游的RAS-MAPK和PIK3CA信号通路，通过各种信号转导通路将有丝分裂等信号传递入细胞核，诱导相应基因表达，进而调节肿瘤细胞的分裂和增殖(Kim et al.,J Biochem Mol Biol,2003,3649-59)。 

Gleevec（格列卫）和Sutent（索坦）是针对PDGFR α靶点开发一类小分子肿瘤靶向药物，通过抑制PDGFR α激酶的磷酸化及其相关通路，从而阻断下游信号的传导，达到抑制肿瘤生长的目的。目前，Gleevec是胃肠道间质瘤(Gastrointestinal stromal tumor)和黑色素瘤（Melanoma）患者的一线治疗药物，然而，Gleevec治疗会易引起肿瘤化疗的耐药性。临床研究显示，PDGFR α的D842V突变是导致胃肠道间质瘤和黑色素瘤患者对Gleevec化疗原发耐药的主要原因(Heinrich,Corless et al.2003J Clin Oncol.21，4342-4349)。在含有PDGFRαD842V突变患者中，其Gleevec或Sutent化疗的客观有效率和缓解率显著低于PDGFRαD842V非突变患者。因此，检测肿瘤患者的PDGFR α基因D842V的突变情况可以有效用于Gleevec和Sutent化疗的预后。在实施化疗之前，通过高灵敏的方法对PDGFR α基因突变检测对于延长肿瘤患者生存期，提高治疗效果和生存质量，避免过度化疗，指导临床科学用药有重要意义。 

目前检测PDGFRα基因突变的检测方法主要为DNA直接测序法。然而，直接测序的灵敏度低，检测灵敏度只有20-30%；实验操作复杂，检测效率低、样品易污染、通常要1-2天才可出检测结果。特别是对于小样本的检测，直接测序的方法几乎无法实现其准确检测，会导致大量漏检及假阴性的发生。包括PDGFRα基因在内的基因突变属体细胞稀有突变，具有稀少性、异质性、不稳定性的特点，而且临床检测样本多数为小样本检测。因此，直接测序等技术无法满足临床检测的实际需求，临床迫切需要开发一种高灵敏度，快速的PDGFRα基因突变检测技术，以实现采用高灵敏度检测方法对PDGFRα基因驱动突变进行 检测，从而为临床肿瘤的个体化治疗方案提供科学参考。 

本发明开发一种快速，高灵敏、操作简便的PDGFRα基因突变检测试剂盒及检测方法。该检测方法灵敏度高，检测时间只需90分钟即可完成，同时具备了灵敏度高，特异性好，快速准确等优点。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测PDGGFRα基因突变的特异引物和探针，或与其有同一性核苷酸序列，该检测试剂盒包含以下引物及探针序列： 

表1引物与探针核苷酸序列 

此处所述的“同一性核苷酸序列”表示在严格条件下（最大严紧性条件下）与靶杂交的寡核苷酸，以及在具有适当的核苷酸插入或缺失情况下进行对比时，在核苷酸的至少约60%的核苷酸相同于上述核苷酸片段。更佳地，为具有80%同一性的核苷酸，最佳地，为具有90%同一性的核苷酸。 

杂交条件根据杂交时所用条件的严紧性程度来分，严紧性程度可以核酸结合复合物或探针的的解链温度（Tm）为依据。例如，“最大严紧性”为Tm-5℃（低于探针Tm 5℃）；“高等严紧性”发生在Tm以下约5-10℃；“中等严紧性”发生在Tm以下约10-20℃；低严紧性发生在Tm以下约20-25℃。 

在本发明中，“同一性”指，两种或以上的序列或亚序列进行比较时，相同或具有特定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基。用于确定序列同一性和序列相似性百分数的算法是根据BLAST或BLAST2.0算法，它们分别在以下文献中公开：Altschul等（1977）Nucl.Acid.res.25:3389-3402和Altschul等（1990）J.Mol.Biol.215:403-410.