[发明专利]蛇毒神经生长因子活性多肽的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及蛇毒神经生长因子活性多肽的筛选方法。

背景技术

神经生长因子（Nerve Growth Factor，NGF）具有广泛的临床应用前景，主要表现在：促进神经元的发育和分化，减轻病理状态下神经元损伤，促进神经元修复和再生；诱导血管内皮细胞，促进血管生成；提高细胞溶酶体内各种水解酶活性，增强巨噬细胞吞噬能力，及诱导细胞凋亡等。蛇毒神经生长因子（Venom NGF，vNGF）与人类NGF的同源性在66％-80％之间，对人类神经细胞具有可靠的正向调节作用，作用机制相通，存在相似的多肽刺激和激活领域。目前，国内外已对vNGF进行了大量的基础性研究，但有关临床应用的研究和实践甚少，主要受限于以下原因：由于NGF促进生长和诱导细胞凋亡的双重功效，疗效尚不十分确切；vNGF原料不易获取，纯化过程繁杂；进入体内后，活性维持和作用效果不详。故而，迄今为止，vNGF尚未能在临床上得到较好的应用。

目前，在已知的神经生长因子β链118个氨基酸序列中，以小鼠NGF的cDNA为探针，已从人的DNA文库中克隆出人类NGF的基因编码鼠、人类、牛、鸡胚和蛇的NGF cDNA已经被测序和克隆。因为蛇毒中NGF含量最丰富，同时蛇类NGF与人类的同源性在66％-80％之间，但对人类神经细胞依然具有可靠的正向调节作用，作用机制相通，存在相似的多肽刺激和激活领域，因此备受人们关注。vNGF的代表株是一种活化的重组蛇毒神经生长因子——sputa NGF，被证明在体内外均是无毒的，更具安全性。对比11株已登录的vNGF的mRNA序列，我们发现vNGF具有高度的同源性，介于93％-99％，其变异点主要集中在441位点、541位点和555位点。Kostiza等根据亚基数目以及亚基之间的结合方式将蛇毒分为四类，并指出β-亚基是NGF的活性部位。NGF生物活性的发挥是通过受体介导的，NGF受体有两类：TrKA和P75，分别以高、低亲和力结合NGF。TrkA受体属于酪氨酸激酶家族，与NGF结合后，可激活Ras、Akt等多条信息途径，调节神经细胞的存活、生长和分化。P75受体的效应主要是诱导细胞凋亡。

本研究以sputa NGF为模板，通过基因重组构建2个组蛋白标记的融合蛋白质作为研究模型的不同多肽刺激物；通过不同长度的功能多肽片段刺激研究模型细胞——鸡胚背根神经节组织和大鼠肾上腺嗜铬细胞(pheochromocy toma cells，PC12)，解析其两个不同受体TrKA和P75的活化状态，及细胞内信号转导的信息表达水平和磷酸化水平，利用特异性细胞信号分子活化抑制剂阻断细胞内特定分子的信号转导，综合判断vNGF的功能区域，从而鉴定vNGF的具有活性的多肽组成和序列，为具有单一取向的蛇毒神经生长因子活性多肽的新药生产提供分子生物学数据和奠定理论基础。

发明内容

为解决现有技术存在的问题，本发明目的是提供一种利用基因重组技术分段筛选蛇毒神经生长因子活性多肽的方法。

本发明所述蛇毒神经生长因子活性多肽的筛选方法，其包括以下步骤：

一、融合蛋白质的构建：选择活化的重组蛇毒神经生长因子，以sputa NGF(vNGF)为模板，进行功能区域断点分析，然后通过PCR引物法构建至少两个不同长度的片段序列，并作标记。

二、质粒表达系统的构建：将上述片段序列分别组装在pBluscriptII SK+质粒中，构建vNGF的转移载体，并使其在DH5a中克隆，形成活性多肽质粒转移系统，然后利用单一酶切点的黏性末端连接方法将具有相同黏性末端的至少两个不同长度的基因片段和目的片段连接，分别组装在pQE30质粒的BamHI和HindIII酶切位点之间，克隆并表达vNGF的活性多肽。

三、通过6X组氨酸回收提纯技术进行分离、鉴定、提纯，形成vNGF活性多肽的刺激物原液。

四、验证原核表达vNGFβ片段的生物活性，进行多肽筛选。

所述片段序列为2个，分别为：vNGF F1片段，对应20-388基因位点，计369bp；vNGF F2片段，对应389-751基因位点，计363bp。

所述验证原核表达vNGF片段的生物活性的方法为：大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤培养检测法。

本发明所述蛇毒神经生长因子活性多肽的筛选方法，其有益效果是：