[发明专利]一种提高植物耐盐性的棉花耐盐基因GarCIPK

说明书

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，是一种提高植物耐盐性的棉花GarCIPK基因。

背景技术

     土壤盐渍化是当今全球性的资源环境问题和生态问题。据统计，全世界约有10亿公顷的土地存在不同程度的盐渍化， 占世界陆地总面积的约10%，而我国就有近一亿公顷盐渍化土地，随着经济的发展，工业污染的加剧, 不合理的灌溉和化肥施用不当等原因, 次生盐渍化土壤面积在逐年扩大,使农业可持续发展受到严重阻碍。改良利用、综合治理盐渍土，培育耐盐新品种以提高植物耐盐性已成为发展未来农业及环境治理的重大课题。因此，探讨盐适应机理、挖掘耐盐功能基因、培育耐盐新品种以提高植物抗盐性具有重要的理论意义。

利用转基因技术将具有优良性状的基因转入植物中，以此开发高效的转基因新品种具有广阔的应用前景。一些研究已表明将植物本身及其他植物中耐盐相关基因转入植物中，通过转录表达可以提高转基因植物的耐盐性。

      CIPK与CBL有效结合形成CBL-CIPK复合体，参与Ca^2 + 信号系统应答逆境胁迫，将信号传递到终端调控下游的胁迫相应基因的表达，最终使植物体内某种胁迫达到平衡。目前，已鉴定出部分CBL-CIPK信号系统的成员，并在一些模式植物的研究中解析了该信号网络在植物应答逆境胁迫的功能，但棉花中的相关研究较少。

发明内容

本发明提供一种提高植物耐盐性的棉花蛋白磷酸激酶CIPK类蛋白基因GarCIPK，所述基因cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的提高植物耐盐性的棉花GarCIPK基因编码的蛋白质，具有序列表中SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列。

本发明提供了含有上述棉花蛋白磷酸激酶基因GarCIPK的植物表达载体pCAMBIA2301。将棉花蛋白磷酸激酶基因GarCIPK克隆到pCAMBIA2301，获得pCAMBIA2301-CaMV35S-GarCIPK和pCAMBIA2301-RD29A-GarCIPK。

本发明所述基因GarCIPK在培育耐盐植物中的应用。所述植物优选是烟草。

本发明的有益效果：利用现有的植物基因工程技术，利用电子克隆及RT-PCR技术，分离与鉴定棉花耐盐相关基因序列信息，并通过根癌农杆菌介导法将基因转入烟草，经过耐盐表型鉴定证明转基因植株的耐盐力明显提高。

附图说明

图1 GarCIPK基因全长cDNA序列的扩增结果

图2、3实时荧光定量PCR法（qRT-PCR）分析盐处理不同时期GarCIPK基因在叶片和根中的表达情况

图4植物表达载体pCAMBIA2301-CaMV35S-GarCIPK和pCAMBIA2301- RD29A-GarCIPK的构建

  （a）大肠杆菌pCAMBIA2301-CaMV35S-GarCIPK PCR检测电泳结果；（b）大肠杆菌pCAMBIA2301-RD29A-GarCIPK PCR检测电泳结果；（c）pCAMBIA2301-CaMV35S-GarCIPK的酶切鉴定；（d）pCAMBIA2301 -RD29A-GarCIPK质粒酶切鉴定

图5 转基因植株的PCR鉴定

    (a) PCR 扩增载体pCAMBIA2301-CaMV35S-CIPK抗性烟草目的基因；(b) PCR 扩增载体pCAMBIA2301-RD29A-CIPK抗性烟草目的基因

图6 转基因烟草及野生型对照在不同浓度NaCl处理下的生长

（a）、（b）、（c）：生长在含不同浓度NaCl的MS培养基上

图7根系长度的测量 NaCl 条件下，25°C 培养第 10 天的根长表现。此图表示0mM、 150mM  和 200mM NaCl 条件下野生型和转基因株系萌发率的统计分析

具体实施方式

实施实例1、GarCIPK基因的获得

 1.1  RNA的提取 

提取RNA

（1）取0.5g新鲜棉花组织，加入0.1g交联聚乙烯砒咯烷酮（PVPP），在液氮中充分研磨至粉末，将冻粉末迅速转入10ml离心管中，加5ml CTAB提取液与500μL0.1M pH8.0的Tris-HCl，65℃水浴20min，中途翻转混匀；

（2）加等体积氯仿充分混匀，冰浴静置10min；