[发明专利]一种羰基还原酶、基因和突变体及在不对称还原羰基化合物中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种羰基还原酶及其基因和突变体，含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，其重组酶和该重组酶的制备方法，以及该羰基还原酶或其重组酶作为催化剂在不对称还原手性羰基化合物以制备光学活性手性醇中的应用。

背景技术

手性醇是许多畅销药物及手性化学品的重要中间体。例如，(R)-邻氯扁桃酸甲酯(分子式为o-Cl-C₆H₄CH(OH)COOCH₃，分子量为200.62，CAS号：32345-59-8)是合成血小板聚集抑制剂氯吡格雷的重要手性中间体。氯吡格雷是一种二磷酸腺苷(ADP)受体阻滞剂，可与血小板膜表面ADP受体结合，使纤维蛋白原无法与糖蛋白GP Ⅱb/Ⅲa受体结合，从而抑制血小板相互聚集，主要用于治疗急性心肌梗死，在国内具有广泛的市场。(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯(分子式为C₆H₅(CH₂)₂CH(OH)COOCH₂CH₃，分子量为208.25，CAS号：90315-82-5)是合成多种血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)普利药物，如贝那普利、西拉普利等的重要手性砌块。该类药物主要用于治疗高血压、充血性心力衰竭等疾病。(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(分子式为ClCH₂CH(OH)CH₂COOCH₂CH₃，分子量为166.60，CAS号：90866-33-4)是L-肉碱的重要手性中间体。L-肉碱是一种促使脂肪转化为能量的类氨基酸，服用L-肉碱能够在减少身体脂肪、降低体重的同时，不减少水分和肌肉，在2003年被国际肥胖健康组织认定为最安全无副作用的减肥营养补充品。因此，研究上述光学纯手性醇的手性合成制备具有广阔的应用前景。

光学活性手性醇的合成有化学法和生物法两种。与化学方法相比，生物法具有反应条件温和、转化率高、对映体选择性高等多种优点，特别是生物催化的羰基不对称还原反应在手性醇不对称合成中的应用越来越受到重视。

(R)-邻氯扁桃酸或其衍生物酯的生物不对称合成方法主要有腈水解酶催化的邻氯扁桃腈的不对称水解以及羰基还原酶催化的邻氯苯甲酰甲酸酯的不对称还原。张志钧等用粪产碱杆菌(Alcaligenes sp.ECU0401)来源的腈水解酶在水-甲苯两相体系中催化消旋邻氯扁桃腈的动态动力学水解拆分制备(R)-邻氯扁桃酸，底物浓度为200mM，产物的对映体过量值(ee)为90.4％，产率为76.5％(J.Biotechnol.2011，152，24-29)。Ema等用面包酵母来源的羰基还原酶Gre2p催化邻氯苯甲酰甲酸甲酯不对称还原制备(R)-邻氯扁桃酸甲酯，底物浓度为200g/L，产物的ee值高于99％以上，分离得率为89％(Adv.Synth.Catal.2008，350，2039-2044)。为实现高的产率，该反应额外添加了1g/L的NADP⁺辅酶，由于辅酶价格昂贵，使得该反应不尽如人意。(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的制备通常是采用野生菌或重组工程菌的细胞或游离酶催化2-羰基-4-苯基丁酸乙酯不对称还原的方法。在已报道的应用中，底物浓度的最高水平是400mM(82g/L)，所用催化剂为预处理的面包酵母(Baker’s yeast)，但是反应48h后仅有41.9％的底物转化成(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯，且对映体过量值(ee)只有87.5％(Biocatal.Biotransfor.2009，27，211-218)。其他的一些报道中可以获得高光学纯度的产物，但是产物浓度一般都很低，不具备产业化的可行性。Zhang等用克鲁氏假丝酵母(Candida krusei SW2026)催化制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯，底物浓度为2.5g/L时，ee值达99.7％，分离得率为95.1％。但当底物浓度提高到20g/L后，ee值降低到97.4％(Process Biochemistry 2009，44，1270-1275)。Lavandera等用重组醇脱氢酶催化5g/L的2-羰基-4-苯基丁酸乙酯还原制备(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯，产物的ee值高于99％，但是反应中需要外源添加1mM NADH，大幅度提高了其成本(ChemSusChem 2008，1，431-436)。林文清等用筛选的博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)等菌株，在水相和水/有机两相两相体系中，催化2-羰基-4-苯基丁酸乙酯不对称还原，产品ee值为84.9％～98.9％，且报道的最高产物浓度仅为50g/L(中国专利，公开号CN 101314784A)。褐色掷孢酵母(Sporobolomyces salmonicolor)来源的醛还原酶SSAR可以催化4-氯-3-羰基丁酸乙酯不对称还原制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，底物浓度可以达到300g/L，但是ee值为91.7％，并不尽如人意。因此针对以上叙述的三个底物，寻找一种羰基还原酶，能够催化高底物浓度下的高立体选择性不对称还原，反应过程中无需额外加入辅酶或者添加极少量辅酶，无疑具有广泛的应用前景。