[发明专利]一种食用安全性整合型螺旋藻高效表达载体及其应用技术

说明书

技术领域

本发明涉及一种食用安全性整合型螺旋藻高效表达载体及其应用技术，属生物技术领域。

背景技术

钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)又称蓝细菌，属于蓝藻纲，藻殖段目，颤藻科，是一种低等单细胞原核植物(如无特别说明本专利所指螺旋藻均为钝顶螺旋藻)。螺旋藻富含蛋白质、矿物质、B族维生素、β-胡萝卜素、必需脂肪酸等营养成分，螺旋藻对多种疾病有预防及辅助治疗的作用，是一种天然的营养保健食品(Mar.Biotechnol.，2004，6：355-363；Bioresource Technology，1999，70：89-93)。

整合型表达载体是指能够将外源目的基因插入宿主细胞基因组中稳定遗传的表达载体，相对于附加型质粒表达载体，整合型表达载体具有更高的遗传稳定性。

自杀性质粒载体是指由于其所含的复制起点，在转化进入目标宿主细胞后不能被其识别起始该质粒复制，最终自动消失的质粒载体。

自杀性质粒pSZ21(如图1)，由质粒pACYC184衍生而来，大小为11.4kb，包含Tn5转座子序列、来源于Tn9的氯霉素抗性基因和pACYC184的复制起点。由于其骨架质粒pACYC184的复制起点不能在大肠杆菌以外的宿主细胞中进行复制，当pSZ21转入其他受体如螺旋藻时，质粒最终将被降解而消除，除非在此之前质粒上的Tn5转座子发生了转座而整合进宿主细胞基因组中，整合单元才会对宿主细胞产生影响(科学通报，1990，4：302-305；Mol.Gen.Genet.，1984，196：413-420)。

Tn5转座子最早是在Escherichia coli中被发现的，序列全长5818bp，包括含有卡那霉素抗性基因、新霉素抗性基因、链霉素抗性基因的中央序列和两个1534bp的末端反向重复序列(IS50)，其结构如图2所示。Tn5转座子属于非复制型转座子，可以在转座酶Tnp的作用下，从供体DNA跳跃到受体DNA。Tn5转座子属于IS4家族，左末端(IS50L)和右末端(IS50R)高度同源，唯一不同的是IS50L的第1442碱基处有一个赭石突变，该突变使得IS50L不能像IS50R一样编码有功能的转座酶。IS50R除了编码转座酶(Tnp)外，还编码一个阻遏蛋白(Inh)。IS50的19bp的倒置末端是Tnp的作用位点。包含3个抗生素抗性基因的中央序列对转座并不起任何作用。IS50L的右端1413bp-1462bp处为抗生素抗性基因的启动子，启动三个串联抗性基因的转录(Mol. Cell Biol，2001，21：459-466；J. Biol. Chem，1999，274：86-92；广西农业生物科学，2003，22：316-320)。

绿色荧光蛋白(green fluorescence protein，GFP)是从水母(Aequorea victoria)体内发现的发光蛋白，分子质量为26kDa，由238个氨基酸构成，在蓝色波长范围的光线激发下，该蛋白会发出绿色荧光。绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是分子生物学中常用的报道基因。

胰高血糖素样肽-1(glucagon-likepeptide-1，GLP-1)又称促胰岛素，是一种由远端回肠及结肠的L细胞分泌的促胰岛素。GLP-1具有影响胃肠动力、抑制胃酸分泌、抑制胰高糖素分泌、引起饱食感、减少摄食活动、增加依赖于葡萄糖的胰岛素分泌以及胰岛β-细胞增生等作用。天然GLP-1在体内很快被DPP-IV(二肽酶IV)在N端第二位脯氨酸(Pro)和丙氨酸(Ala)之间特异性切割而失活，其体内半衰期仅2-5分钟(Lancet，2006，368：1696-1705)。

发明内容

本发明的目的是：

1)以质粒pSZ21为基础，在保留其Tn5转座(重组)功能的情况下去除转座子中卡那霉素、新霉素、链霉素抗性基因，构建转座单元不含抗生素基因的载体p21GZ。

2)克隆螺旋藻特异性启动子AP，构建包含GFP、AP、10GLP-1串联结构的表达单元GAG。

3)构建含有GAG表达单元的表达载体p21GZ-GAG和携带该载体的大肠杆菌株系。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

首先，本发明提供了一个去除pSZ21重组部分中的卡那霉素、新霉素、链霉素抗性基因的表达载体p21GZ。