[发明专利]四氢呋喃醚衍生物可裂解连接单元及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及化学合成和生物化学领域，具体涉及一种可用于DNA合成测序的四氢呋喃醚衍生物可裂解连接单元及其用途。

背景技术

DNA测序技术是现代生物学研究中重要的手段之一。人类基因组计划完成后，DNA测序技术得到了迅速发展。DNA测序(DNA sequencing)是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)的排列方式。发展精确、高通量、低成本的DNA测序方法对于生物、医药科学等具有非常重要的意义。

合成法测序(Sequencing By Synthesis，SBS)是新一代DNA测序技术之一。合成法测序方法通过把大量被测的模板DNA片段进行固定，并在固定化的DNA测序模板上杂交结合通用的DNA引物，分别控制4种核苷酸在DNA引物上的延伸。通过检测延伸反应过程或延伸核苷酸，实现高通量并行的DNA序列信息的检测。

在合成法测序中，首先要合成DNA链延长的四种核苷酸原料，又叫“可逆终端”(reversible terminator)。这类核苷酸除了要求3′-羟基阻断外，为了不影响下一个指示核苷酸的并入和识别，还要求通过一个可裂解的连接单元把核苷酸和指示分子，例如荧光素，连接起来。然后，在下一个指示核苷酸并入之前，在温和的条件下使这个连接单元断裂，继续DNA链的延长，从而读出DNA碱基的序列。该连接单元对合成法测序的读长和效率有重要的影响，因此，人们也一直致力于发展新的可裂解连接单元，来提高DNA测序的效率。目前已报道的连接单元有还原剂敏感(二硫键，偶氮化合物)；光裂解(邻硝基苄基衍生物，苯甲酰甲基酯衍生物及其它光可裂解连接单元)；亲电子试剂/酸敏感(酸裂解；叠氮化合物)；金属作用下的裂解；氧化剂敏感等。然而这些连接单元都存在各自不同的缺点与局限性(Bioorganic&Medicinal Chemistry 2012，20，571-582)。

可裂解连接单元对合成法测序的读长和效率有重要的影响，而现有的连接单元存在裂解条件不够温和、裂解效率不高，用于测序时读长太短等缺点，因此，设计、合成新的可裂解连接单元，并探索合适的裂解条件对于提高测序的效率、发展新的测序方法有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一类新的可用于DNA合成测序的四氢呋喃醚衍生物可裂解连接单元及其用途。在合成测序中，该类连接单元的断裂效果即测序效果与原料的手性因素无关，也就是说在合成的四氢呋喃环衍生物中，无论是顺式、反式或二者的混合物都可用于测序，并具有相同的作用。该类化合物合成原料简单易得，合成过程均为常规化学反应，易于实现大量合成。该类化合物可与核苷酸和荧光素实现高效率的连接。通过研究该类化合物的裂解性能，发现该类化合物在温和的条件下可以实现高效率的裂解，具有应用于DNA测序的价值。

发明人在前期工作中，发展了一种可裂解连接单元，该类连接单元包含四氢吡喃醚和四氢呋喃醚两种(申请号：201110331659.1)，可用于DNA合成测序。与前期工作相比，本发明进一步改进了T系列化合物的合成方法，并增加了YZ和ZY系列化合物，在T系列化合物改进的合成方法中，避免了使用剧毒化学品MsCl，同时减少了一步反应。并且反应原料不再局限于L谷氨酸，也可以为D型或DL型谷氨酸，所合成的四氢呋喃衍生物无论是顺式，反式或二者的混合物均可用于DNA合成测序，并具有相似的裂解性能。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

第一方面，本发明涉及一种四氢呋喃醚衍生物可裂解连接单元，其结构式如式(I)所示：

(I)，其中，n为0～44中的任意一个整数。

优选地，所述可裂解单元的结构式如式(II)所示：

(II)，其中，n为0～44中的任意一个整数。

进一步地，所述式(I)中n为21～44中的任意一个整数。

进一步地，所述可裂解连接单元是通过以下步骤合成的：

a、T-1的合成：D，L或DL-谷氨酸，在盐酸和亚硝酸钠作用下，发生环化反应得到T-1；

b、T-2的合成：T-1在硼烷的醚类溶剂中，发生还原反应得T-2；

c、T-3的合成：取T-2，以二氯甲烷做溶剂，加入咪唑，惰性气体保护下和二甲基叔丁基氯硅烷反应得T-3；

d、T-4的合成：以二氯甲烷做溶剂，T-3在惰性气体保护及冰盐浴下和二异丁基氢化铝反应，得T-4；