[发明专利]一种气泡上升法检测纤溶酶效价的方法

说明书

技术领域

本发明涉及制药技术领域，尤其涉及一种气泡上升法检测纤溶酶效价的方法。

背景技术

纤溶酶蛋白水解酶，是用于脑梗死、高凝血状态及血栓性脉管炎等外周血管疾病。本品作用于纤维蛋白原及纤维蛋白(血栓前体蛋白)，使其降解为小分子可溶片段，容易分解和从血循环中清除，从而产生去纤维蛋白效应；本品促使组织纤溶酶原激活物(t-PA)由内皮细胞释放，并增强其活性，故具抗血栓功能；本品可降低血小板聚集及血液黏度；本品还具有降低心肌耗氧量，改善微循环的功能。本品静脉注入人体内，3小时后血药浓度达到最高，药品本身及其降解产物均可通过血-脑脊液屏障，主要经肾脏、肝脏代谢后随尿液排出。

蛇毒纤溶酶的降纤抗凝、溶解血栓作用，早在二十世纪七十年代就有报道，但其成分复杂，含有多种毒素，极少量杂质成分的残留可能会产生致命反应。因此是否可以分离纯化获得单一活性成分，决定了蛇毒纤溶酶的应用前景。本公司经过十几年的努力，解决了这一技术难题，本公司研制的纤溶酶纯度高、无出血毒、神经毒、异常毒等毒性，具有降纤抗凝、溶解血栓等作用，且具有疗效好、再次梗塞率低的特点，是新一代理想抗血栓药物，并实现了纤溶酶的产业化生产。

为了保证一个药品能够安全有效地应用于临床，在研制过程中必须进行质量研究，制定出一系列的质量控制标准。对于纤溶酶来说，保证临床疗效的唯一并且关键技术方法决定于酶的活性，而评定酶的活性除了临床效果观察(药效学)之外，最主要的是要有一种准确、标准、稳定的酶活力检测方法。因此，研究一个操作简单、准确可靠而又稳定的评定酶活力的测定方法是该品实现产业化必不可少的重要环节。我们经过十多年的努力和反复试验发明了本方法。目前文献中使用的此类酶的效价测定有以下两种测定方法：

一、纤维蛋白平板法：纤维蛋白平板法是最早用于纤溶活性测定的方法之一，是将琼脂糖、血纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液按一定比例混合，制成人工血栓平板。在平板上点上系列标准样和待测的样品，于37℃下恒温培养18h，测量酶在平板上产生的溶圈直径，然后以标准品浓度的对数为横坐标，以溶圈面积的对数为纵坐标，进行线性回归并绘出线性回归曲线，根据线性回归曲线求得所述供试品溶液的效价。该法优点是简便直观，但存在以下不足：

1、测定值易受平板均匀度、恒温孵育时间等因素的影响。

2、制板操作麻烦，平板的厚度和成分不容易均匀。

3、同一平板上检测的样品数量少。

4、反应时间长，不便于生产过程控制。

5、溶圈形状有时不规则，检测溶圈直径的误差大。

二、紫外分光光度法：即紫外分光光度法测定所生成的分解产物的吸光度变化。就是利用凝血酶将纤维蛋白原活化形成交联纤维蛋白，制成人工血栓，再加样品进行人工血栓分解，以紫外分光光度计测定所生成的分解产物的吸光度变化，计算出纤维蛋白溶解酶活性的方法。(在规定条件下，1分钟溶解1μg纤维蛋白(可凝固蛋白)为一个纤溶酶活力单位)。紫外分光光度法(国家药品标准WS-10001-(HD-0805)-2002)存在以下不足：

1、该法水解反应后多次洗涤剩余的纤维蛋白，洗涤过程中因胶块容易碎而丢失，影响检测结果。

2、操作繁琐、耗时长，不便于生产过程控制。

3、纤维蛋白原来源于动物血液，成分复杂、杂质量不确定，杂质不同程度地抑制纤溶酶效价，甚至不同批次的纤维蛋白原都将影响纤溶酶效价测定。

发明内容

为解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种测定结果准确可靠、操作简单、快速，并克服了不同来源或不同批次纤维蛋白原对效价测定的干扰的气泡上升法检测纤溶酶效价的方法。

本发明所述气泡上升法检测纤溶酶效价的方法，其测定步骤为：

一、配制供试品溶液：取供试品纤溶酶适量，然后加入pH6-9的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液，根据供试品效价估计值将所述供试品纤溶酶稀释为每1毫升中含10-10000单位的溶液；

二、配制纤溶酶标准溶液：取纤溶酶标准品适量，加入pH6-9的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液稀释成每1毫升中含10-10000单位的至少两种不同浓度的标准品溶液；