[发明专利]一种真核重组质粒及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，特备涉及一种真核重组质粒及其制备方法与在制备治疗喉鳞癌的药物中的应用。

背景技术

近年来，恶性肿瘤对人类的威胁日益突出，肿瘤已成为死亡常见原因之一，严重影响着人类的健康。人喉鳞癌是一种常见的恶性肿瘤，现在已经发现部分癌基因(如survivin、c-myc、Bcl-2等)和抑癌基因(如p53、DCC、nm23、APC、PTEN、DPC4等)，所述癌基因和抑癌基因与人喉鳞癌的发生、发展有密切关系，但是至今还有许多的致癌基因、抑癌基因尚未发现。

人FBXL20基因已在GenBank注册，注册号NM_032875，定位于17q12，全长10381bp，编码436aa。FBXL20的组织表达谱分析显示：该基因在脑少突神经胶质细胞瘤、脑星形细胞瘤、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、睾丸癌、软骨肉瘤中均有表达，FBXL20为F-BOX蛋白家族的新成员，编码产物含一个F-BOX功能区，现已在人体内发现20余种F-BOX蛋白，有cyclinF、skp2、E3RSIkB、CDC4、b-TrcP、MET30、MD6等。目前国内外对F-BOX蛋白的研究主要是围绕泛素化-蛋白酶体途经(UPP)展开的。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的真核重组质粒及制备方法，并证明这种真核重组质粒可促进喉鳞癌细胞的凋亡，以便开发出一种治疗喉鳞癌的新型药物。

人FBXL20基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所述。本发明所述真核重组质粒，由序列表中SEQ ID NO.1所示人FBXL20基因的核苷酸序列中的CY-FBXL20片段与真核载体构建而成，所述CY-FBXL20片段是起始密码子下游10045bp至10063bp的核苷酸序列。

本发明所述真核重组质粒，其制备方法依次包括以下步骤：

(1)通过RNA固相合成法，获得人FBXL20基因中的CY-FBXL20片段的RNAi片段；

(2)将所述CY-FBXL20片段的RNAi片段插入到真核载体构建真核重组质粒，该插入片段的酶切位点分别为BamI和BbsI，再将所述真核重组质粒转化至感受态细菌中进行培养，然后筛选出含有正确插入片段的克隆；

(3)使用碱裂解法抽提所构建的真核重组质粒，利用限制性内切酶酶切图谱分析所构建的真核重组质粒，并进行DNA序列分析。

上述真核重组质粒及其构建方法中，所述真核载体为GPU6、pGPH1、pGPU6/GFP/Neo、pGPU6/Neo、pGPH1/Neo、hU6-MCS-CMV-GFP-SV40-Neomycin、pGPU6/Hygro、pGPH1/Hygro、pGPU6/GFP/Neo、pGPH1/GFP/Neo、H1-MCS-CMV-GFP-SV40-Neomycin、CMV-EGFP-MCS(MIR30)-SV40-Neomycin、CMV-RFP-MCS(MIR30)-SV40-Neomycin中的一种。

本发明将所构建的真核重组质粒转染入喉鳞癌Hep2细胞，实验表明，该真核重组质粒对喉鳞癌细胞具有明显的杀灭作用(见实施例2)，可在制备治疗喉鳞癌的药物中应用。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明为制备治疗喉鳞癌的药物提供了一种新方法，可促进喉鳞癌新药的开发，有利于喉鳞癌恶性肿瘤患者的康复。

2、本发明所述真核重组质粒不仅可在制备治疗喉鳞癌的药物中应用，而且可用于探讨喉鳞癌发病的分子机理。

附图说明

图1是真核载体pGPU6/GFP/Neo的结构示意图。

图2是本发明所述真核重组质粒的一种结构示意图(pGPU6/GFP/Neo/-CY-FBXL20)。

图3是靶序列的DNA的双链结构。

图4是shRNA-CY-FBXL20转录体。

图5是shRNA-CY-FBXL20转录体的二级结构。

图6是阴性片段DNA双链结构。

图7是shRNA-NC转录体。

图8是shRNA-NC转录体的二级结构。

图9是本发明所述真核重组质粒pGPU6/GFP/Neo/CY-FBXL20的酶切鉴定图谱。

图10是本发明所述真核重组质粒pGPU6/GFP/Neo/CY-FBXL20的测序图。

图11是稳转真核重组质粒pGPU6/GFP/Neo/CY-FBXL20的喉鳞癌Hep2细胞株照片；