[发明专利]一种犬细小病毒蜂胶灭活疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种犬细小病毒蜂胶灭活疫苗及其制备方法，属于兽医生物制品技术领域。

背景技术

犬细小病毒（Canine Parvovirus，CPV）感染是多发生于犬科动物的一种烈性传染病。临床表现以急性出血性肠炎和非化脓性心肌炎为特征。CPV属细小病毒科，细小病毒属。CPV对多种理化因素和常用消毒剂具有较强的抵抗力。犬感染CPV发病急，死亡率高，常呈暴发性流行；不同年龄、性别、品种的犬均可感染；本病发生没有明显的季节性。

近年来，随着我国工作犬（军犬、警犬、导盲犬等）、实验用犬和宠物犬饲养量的大幅增加，犬细小病毒感染日趋严重，给养业犬带来了重大的经济损失，成为危害养犬业重大疫病之一。本病发病迅速，疫苗免疫接种是预防本病的有效措施。

本发明的目的是制备出一种安全、有效的犬细小病毒蜂胶灭活疫苗，并以蜂胶作为佐剂制备一种犬细小病毒蜂胶灭活疫苗。

发明内容

本发明的目的是利用犬细小病毒株作为生产疫苗的毒株，通过在F81细胞在进行病毒繁殖，经过收获、灭活，并以蜂胶作为佐剂制备一种犬细小病毒蜂胶灭活疫苗，以制备一种既能减小犬注射疫苗后的不良反应又能增强犬对该灭活病毒的应答反应。

为达到上述目的，本发明所采用的具体技术方案如下：

一种犬细小病毒蜂胶灭活疫苗，犬细小灭活病毒以蜂胶为佐剂而制成的犬细小病毒蜂胶灭活疫苗。

上述犬细小病毒蜂胶灭活疫苗的制备方法，具体步骤如下：

（1）犬细小病毒的培养及灭活：将细小病毒生产用疫苗株接种F81细胞36℃培养，当接毒细胞有80%出现病变时，收获病毒细胞培养液，经过0.2%甲醛灭活，180转/分钟的摇床内摇48小时，以制备病毒灭活液；

（2）蜂胶液制备；

（3）按每ml疫苗含蜂胶干物质含量为8～15mg标准添加蜂胶溶液搅拌15～20分钟，使其充分混合乳化。

进一步地，所述的蜂胶液制备由以下步骤完成：选取已知纯度的蜂胶，经破碎后过筛，溶于95%的乙醇溶液，再根据要求配成适当浓度的溶液于4℃下保存备用。

（4）本发明是以本发明人于中国兽医药品监察所菌种室购买的一株犬细小病毒CPV1作为生产疫苗的毒株，犬细小病毒CPV1，2003.3.3，冻干（0.5ml），有效期15年。

本发明的犬细小病毒蜂胶灭活疫苗的用途，主要用于控制犬细小病毒病。

具体实施方式

1.细小病毒灭活原液的制备。

（1)将生长良好的F81细胞按常规方法传代，待细胞长成80%单层后，倾去生长液，换以含1%毒种的维持液(含2%新生牛血清的MEM)，置36℃继续培养，转瓶转速为8～lOr／h。

（2)接种后，每日观察细胞病变，当细胞病变(CPE)达80%左右时即可收获，冻融1次，置-15℃以下冻结保存，待检备用。

（3)按病毒液总量的0.2%加入甲醛溶液，充分混匀，置36℃下灭活，待温度升至36℃开始计时，180转/分钟的摇床中不间断摇动，灭活48小时。

2.佐剂原液的制备

选取购自山东临清市清坤蜂蜡巢础加工厂已知纯度的蜂胶，经破碎后过筛，溶于95%的乙醇溶液，再根据要求配成适当浓度的溶液于4℃下保存备用。

3.成品的制备

按每ml疫苗含蜂胶干物质含量为8～15mg标准添加蜂胶溶液搅拌15～20分钟，使其充分混合乳化。

4.犬细小病毒蜂胶灭活疫苗的检验方法

(1)性状  本品静置后，上层为粉红色液体，下层为淡粉红色沉淀，振摇后呈均匀混悬液。

(2)无菌检验按《中国兽药典》规定的方法进行检验，应无菌生长。

(3)安全检验用2～10月龄健康易感犬5只，各皮下注射疫苗3ml，连续观察10日，应全部健活。

(4)效力检验用2～10月龄健康易感犬5只，各皮下注射疫苗Iml，同时设不接种对照犬5只。免疫后14日采血，分离血清，分别测定抗MEV HI抗体，免疫犬抗MEVHI抗体均应≥1：32，对照犬抗MEV HI抗体均应≤1：4。

5.甲醛和汞类防腐剂残留量测定  按《中国兽药典》附录进行测定，应符合兽用生物制品通则的规定。

6.犬细小病毒蜂胶灭活疫苗安全性试验