[发明专利]普通野生稻中受白叶枯病菌胁迫表达的磷酸肌醇3-激酶EST片段

说明书

技术领域

本发明属于生物分子克隆技术领域，具体涉及白叶枯病菌胁迫下的普通野生稻磷酸肌醇3-激酶表达序列标签（Expressend Sequence Tag, EST），并基于该EST片段设计引物，通过半定量RT-PCR检测该磷酸肌醇3-激酶EST片段在普通野生稻中的差异表达方法。

背景技术

目前抗白叶枯病菌基因的发掘主要是通过已知的抗病基因提供的信息进行分离克隆，很难获得新的抗白叶枯病基因。由于白叶枯病病原菌生理小种的不断变异使得栽培稻中原有的抗白叶枯病基因逐渐丧失抗性，而目前对白叶枯病的防治，尚未有行之有效的措施。普通野生稻（Oryza rufipogon Griff.）对各种病虫害抗性强，高抗白叶枯病，甚至免疫，（广东省农科院水稻所野生稻研究组. 普通野生稻种质资源抗性鉴定[J].广东农业科学，2:3-6, 1989；林世成等. 普通野生稻对水稻白叶枯病抗性的评价及遗传研究初报[J]. 中国水稻科学，6(4):155-158，1992. ），因此，通过发掘普通野生稻中高抗白叶枯病的新基因，并从中克隆分离抗病相关基因，对水稻抗病育种具有重要意义。

磷脂酰肌醇3 -激酶( phosphoinositide-3-kinase，PI3K) 是一种与细胞内信号传导有关的脂类第二信使。正常情况下，它们不存在未受刺激的细胞中。一旦细胞受到刺激，它们就迅速产生。PI3K 是细胞内一个重要的分子，PI3K 家族在细胞的增殖、抗凋亡、细胞迁移、膜泡转运、细胞癌性转化等众多过程有关的信号转导方面起重要作用（杨章民, 王一理,司履生. 磷酯酰肌醇-3 激酶家族研究进展[J]. 国外医学: 分子生物学分册，2003，25：285-289.；邱定红. 磷脂酰肌醇-3 激酶研究概况[J]. 国外医学: 遗传学分册，2000，23：30-32.）。本研究从白叶枯病菌胁迫的普通野生稻SSH文库中获得一个EST片段，在NCBI中经BLASTn比对分析，与已知的磷酸肌醇3-激酶基因的同源性为81%，推测该EST片段编码的蛋白为磷脂酰肌醇-3 激酶，故将该EST片段暂命名为磷脂酰肌醇-3 激酶EST片段。

表达序列标签(Expressed Sequence Tags，ESTs)是指从不同组织来源的cDNA序列，这一概念首次由Adams等于1991年提出。近年来由此形成的技术路线被广泛应用于基因识别、绘制基因遗传图谱和物理图谱、定位克隆、寻找新基因、研究基因的功能等研究领域，并且取得了显著成效。

发明内容

本发明目的是克服现有栽培稻中原有的抗白叶枯病基因逐渐丧失，因而缺乏抗白叶枯病的新基因的缺陷和不足，提供一新的普通野生稻中受白叶枯病菌胁迫表达的磷酸肌醇3-激酶EST片段，该磷酸肌醇3-激酶EST片段是与抗白叶枯病相关的基因片段，还提供一种扩增该磷酸肌醇3-激酶EST片段的引物,一种检测磷酸肌醇3-激酶EST片段在普通野生稻中差异表达的方法及其引物，从而为进一步从普通野生稻中分离克隆抗病相关基因奠定基础。

本发明所提供的普通野生稻中受白叶枯病菌胁迫表达的磷酸肌醇3-激酶EST片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

本发明所提供的扩增所述的普通野生稻中受白叶枯病菌胁迫表达的磷酸肌醇3-激酶EST片段的引物由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述的下游引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。

本发明还提供了一种检测磷酸肌醇3-激酶EST片段在普通野生稻中差异表达的引物，它是由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述的下游引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。

本发明所提供的一种检测磷酸肌醇3-激酶EST片段在普通野生稻中差异表达的方法，包括以下步骤： 

1．总RNA 的提取

1）样品的处理

A、待检测样品的处理，用白叶枯病菌菌液接种普通野生稻叶片后，每隔24 h，分别于24 h、48 h、72 h、96 h、120 h 5个时期收集接种该普通野生稻叶片，分别置于研钵中加液氮快速磨碎，每100 mg样品加入1 ml TRIzol提取液，涡旋振荡15s，每个时期的取样为一个处理样品，共5个处理样品；