[发明专利]普通野生稻中受白叶枯病菌胁迫表达的磷酸肌醇3-激酶EST片段

权利要求书

1.普通野生稻中受白叶枯病菌胁迫表达的磷酸肌醇3-激酶EST片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

2.扩增权利要求1所述的普通野生稻中受白叶枯病菌胁迫表达的磷酸肌醇3-激酶EST片段的引物，它由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述的下游引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。

3.一种检测磷酸肌醇3-激酶EST片段在普通野生稻中差异表达的引物，它是由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述的下游引物的碱基序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。

4.一种检测磷酸肌醇3-激酶EST片段在普通野生稻中差异表达的方法，包括以下步骤： 

1．总RNA 的提取

1）样品的处理

A、待检测样品的处理，用白叶枯病菌菌液接种普通野生稻叶片后，每隔24 h，分别于24 h、48 h、72 h、96 h、120 h 5个时期收集接种该普通野生稻叶片，分别置于研钵中加液氮快速磨碎，每100 mg样品加入1 ml TRIzol提取液，涡旋振荡15s，每个时期的取样为一个处理样品，共5个处理样品；

B、对照组的处理，以灭菌双蒸水代替白叶枯病菌菌液接种普通野生稻叶片作为对照组，每隔24 h，分别于24 h、48 h、72 h、96 h、120 h 5个时期收集接种该普通野生稻叶片，分别置于研钵中加液氮快速磨碎，每100 mg样品加入1 ml TRIzol提取液，涡旋振荡15s，每个时期的取样为一个对照样品，共5个对照样品；

2）将步骤1）所述的样品在15～30℃放置5 min；加入氯仿，氯仿的用量为每使用1 ml TRIzol加入200 μl氯仿，盖好管带，涡旋振荡15 s，15～30℃放置3 min；

3）4℃，12000 rpm离心15 min，此时溶液分为三层：黄色的是有机相，中间层和上层无色的是水相，RNA主要存在水相中，把水相转移至另一新的无RNase离心管中；

4）向得到的水相中加入等体积的异丙醇，混匀，15～30℃放置20-30 min；

5）4℃，12000 rpm离心10 min，弃上清；

6）加入DEPC水配制的体积分数为75%的乙醇溶液洗涤沉淀，用量为每使用1 ml TRIzol用1 mlDEPC水配制的体积分数为75%的乙醇溶液；

7）4℃，5000 rpm离心3 min，用枪头小心吸出上层液体，保留沉淀；

8）15～30℃晾干2-3 min，加入30-100 μl无RNase的双蒸水，充分溶解RNA后，5个对照样品RNA混合作为一个总对照样品于-70℃保存，5个时期的处理样品分别于-70℃保存；

2．cDNA第一链的合成

1）在PCR管中依次加入下列成分，反转录反应体系中各个时期的总RNA浓度均为3μg：

Oligo(dT)₁₈         2 μl

dNTP(2.5mM each)   2 μl

RNA               3μg

DEPC水           补足至14μl

2）70℃加热5 min后迅速在冰上冷却2 min，5000rpm离心10s后加入以下各组分：

RNasin              1 μl

5×First-Strand Buffer  4 μl

TIANScript M-MLV   1 μl

3）混匀，5000rpm离心10s；

4）42℃温浴50 min；

5）95℃加热5min终止反应，置冰上进行后续实验或冷冻保存；

3．半定量RT-PCR技术检测普通野生稻磷酸肌醇3-激酶EST片段的差异表达情况

1）RT-PCR反应体系：

总体积25 μl 

10×PCR buffer           2.5μl

MgCl₂                   2 μl 

dNTP(2.5 mM each)       2 μl

上游引物（10 μM）       1 μl

下游引物（10 μM）       1 μl

Taq DNA polymerase(5 U/μl) 0.5 μl

cDNA                   1 μl

ddH2O                  15 μl

以碱基序列如序列表中SEQ ID NO:2所示的上游引物和碱基序列如序列表中SEQ ID NO:3所示的下游引物作为RT-PCR反应引物，分别以步骤2获得的cDNA作为RT-PCR反应模板；

2）PCR反应程序：

94℃预变性5 min，94℃变性35s，43℃退火30s，72℃延伸1 min，35个循环，72℃延伸10 min；

3）PCR结束后进行1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，每个点样孔中上样10 μl PCR产物，检测该磷酸肌醇3-激酶EST片段在普通野生稻叶片未接种白叶枯病菌的对照和接种白叶枯病菌处理后24 h、48 h、72 h、96 h、120 h 5个时期的差异表达情况；当在未接种白叶枯病菌的叶片中检测不到该磷酸肌醇3-激酶EST片段的表达，只在接种了白叶枯病菌的普通野生稻叶片中能检测到它的表达，则该磷酸肌醇3-激酶EST片段属于白叶枯病菌胁迫的诱导型表达基因，当在未接种白叶枯病菌和接种白叶枯病菌的普通野生稻叶片的5个时期均表达，则该磷酸肌醇3-激酶EST片段为组成型表达基因。