[发明专利]猪圆环病毒2型细胞悬浮培养生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞培养生产方法，具体涉及一种应用生物反应器微载体细胞培养技术生产猪圆环病毒2型疫苗抗原的方法。

背景技术

目前，国内猪圆环病毒2型灭活疫苗生产主要都采用细胞转瓶培养方法实现，该传统工艺生产半成品抗原效价低，仅为10^4.5-5.5TCID₅₀/ml，难以达到配苗要求(每毫升抗原含量应≥10^5.5TICD₅₀)，需要进行不同倍数的浓缩。且该法劳动强度大，生产一批需要100-200个转瓶；耗时长，需要6-7天；效率低，每次培养只收获一次；生产成本高，人工、场地及原料费用大；容易被环境污染，转瓶清洗产生的含毒废水需要专门处理；不同生产批次间或同一生产批次不同瓶间的差异大，影响整批抗原质量；难以扩大生产，需要较大场地和GMP厂房；逐瓶接种收获容易出现被细菌或其它病毒污染而致的疫苗质量隐患，涉及生物安全和公共卫生问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有细胞转瓶培养法技术存在的不足之处，提供一种应用生物反应器微载体培养技术生产猪圆环病毒2型疫苗抗原的方法。该方法可以大量降低生产成本，相比转瓶工艺单位抗原降低60-70％，而且生产周期较转瓶工艺缩短2-3天，占用场地小，易于快速扩大生产规模，环境污染少且易于处理，自动化程度高，用人少，质量易于实现均衡稳定。可显著提高疫苗产量和质量。

为达到上述目的，本发明采取了如下的技术方案：

一种猪圆环病毒2型细胞悬浮培养生产方法，选择生物反应器作为培养工具；选择微载体作为细胞贴附的生长载体；选择PK-15克隆细胞接毒制备的带毒细胞作为制苗用细胞；并包括如下步骤：

(1)、带毒细胞的制备和扩增

将细胞状态良好长为单层的健康pK-15克隆细胞消化传代后按照细胞培养体积的1％-5％接种PCV2种毒，培养24-48h待细胞长满50％以上后，换含MEM维持液继续维持48h，待细胞长满后即得到带毒细胞F1代；

(2)、带毒细胞在转瓶上的培养

利用预热的无菌PBS将长满的带毒细胞F1代轻轻洗涤一次，加入15-20ml胰酶消化液消化，不断旋转转瓶直至细胞全部消化脱落，加入MEM生长液终止消化，摇匀，按照1∶2至1∶5的传代比例分瓶；传代后代次为F2，依次类推；

(3)、带毒细胞在生物反应器上的培养

在生物反应器中将Cytodex-1微载体的密度设定为3-5g/L，准备好后备用；

将带毒细胞传代至F3代时挑选状态良好的细胞接种生物反应器，接种的密度为3-4×10⁵个/ml，接种后采用搅拌10-15min，停止10-15min的方法周期间歇性的搅拌维持2h促进细胞贴壁；更换MEM维持液在pH7.4-7.6，DO为50％-70％，搅拌转速为40-50rpm的条件下继续培养；

(4)、病毒的收获和效价测定

所述更换MEM维持液在pH7.4-7.6，DO为50％-70％，搅拌转速为40-50rpm的条件下继续培养50h后静置，吸出上清收获，继续加入的MEM维持液培养40h，观察若细胞大部分已脱落则连同微载体一起全部收获，若细胞状态依然较好则继续收获上清，添加MEM维持液再收获一次，至最后一次收获时连同微载体上的细胞一同收获，反复冻融2-3次后作为半成品测定效价。

进一步的技术方案是，所述的生物反应器为能够自动控制温度、pH、溶氧、搅拌速度参数，适用于微载体培养的生物反应器，容积为3L-3000L；所述的微载体为Cytodex-1，微载体的使用浓度为3-5g/L，培养温度33-38℃、pH6.5-7.6、溶氧30％-70％、搅拌速度40-50rpm，微载体生物反应器在使用前需要采用如下方法进行电极校正，灭菌，平衡：

(1)生物反应器的准备：

根据培养的体积选择合适的生物反应器，连接好各种管道、补料和辅助罐，换液的接口，接上T，pH，DO电极，进行电极的校正；

(2)微载体的准备：

根据培养的体积和微载体浓度称取Cytodex-1微载体于已硅化处理的玻璃瓶中或不锈钢容器中，加入50倍微载体质量的PBS缓冲液浸泡30min，此后更换新鲜的PBS缓冲液继续浸泡2h；更换10倍体积的PBS缓冲液于待灭菌的生物反应器中准备灭菌；

(3)灭菌：