[发明专利]猪圆环病毒2型细胞悬浮培养生产方法

权利要求书

1.一种猪圆环病毒2型细胞悬浮培养生产方法，其特征在于：

选择生物反应器作为培养工具；选择微载体作为细胞贴附的生长载体；选择PK-15克隆细胞接毒制备的带毒细胞作为制苗用细胞；并包括如下步骤：

(1)、带毒细胞的制备和扩增

将细胞状态良好长为单层的健康pK-15克隆细胞消化传代后按照细胞培养体积的1％-5％接种PCV2种毒，培养24-48h待细胞长满50％以上后，换含MEM维持液继续维持48h，待细胞长满后即得到带毒细胞F1代；

(2)、带毒细胞在转瓶上的培养

利用预热的无菌PBS将长满的带毒细胞F1代轻轻洗涤一次，加入15-20ml胰酶消化液消化，不断旋转转瓶直至细胞全部消化脱落，加入MEM生长液终止消化，摇匀，按照1∶2至1∶5的传代比例分瓶；传代后代次为F2，依次类推；

(3)、带毒细胞在生物反应器上的培养

在生物反应器中将Cytodex-1微载体的密度设定为3-5g/L，准备好后备用；

将带毒细胞传代至F3代时挑选状态良好的细胞接种生物反应器，接种的密度为3-4×10⁵个/ml，接种后采用搅拌10-15min，停止10-15min的方法周期间歇性的搅拌维持2h促进细胞贴壁；更换MEM维持液在pH7.4-7.6，DO为50％-70％，搅拌转速为40-50rpm的条件下继续培养；

(4)、病毒的收获和效价测定

所述更换MEM维持液在pH7.4-7.6，DO为50％-70％，搅拌转速为40-50rpm的条件下继续培养50h后静置，吸出上清收获，继续加入的MEM维持液培养40h，观察若细胞大部分已脱落则连同微载体一起全部收获，若细胞状态依然较好则继续收获上清，添加MEM维持液再收获一次，至最后一次收获时连同微载体上的细胞一同收获，反复冻融2-3次后作为半成品测定效价。

2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型细胞悬浮培养生产方法，其特征在于：所述的生物反应器为能够自动控制温度、pH、溶氧、搅拌速度参数，适用于微载体培养的生物反应器，容积为3L-3000L；所述的微载体为Cytodex-1，微载体的使用浓度为3-5g/L，培养温度33-38℃、pH6.5-7.6、溶氧30％-70％、搅拌速度40-50rpm，微载体生物反应器在使用前需要采用如下方法进行电极校正，灭菌，平衡：

(1)生物反应器的准备：

根据培养的体积选择合适的生物反应器，连接好各种管道、补料和辅助罐，换液的接口，接上T，pH，DO电极，进行电极的校正；

(2)微载体的准备：

根据培养的体积和微载体浓度称取Cytodex-1微载体于已硅化处理的玻璃瓶中或不锈钢容器中，加入50倍微载体质量的PBS缓冲液浸泡30min，此后更换新鲜的PBS缓冲液继续浸泡2h；更换10倍体积的PBS缓冲液于待灭菌的生物反应器中准备灭菌；

(3)灭菌：

灭菌前认真检查各管道和接头确保连接完好后进行气密性测试，测试合格后方可准备进行灭菌；根据生物反应器的规模，5L以下采用离线灭菌，在高压锅中121℃高压30min，灭菌结束后取出自然冷却；10L以上的生物反应器采用在位灭菌的方式。

3.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型细胞悬浮培养生产方法，其特征在于：所述MEM维持液的成份体积分数为：MEM为96％，NBCS为2％，D-氨基葡萄糖为1％，双抗为1％。

4.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型细胞悬浮培养生产方法，其特征在于：所述胰酶消化液中胰酶的质量分数为0.25％。

5.根据权利要求1所述的猪圆环病毒2型细胞悬浮培养生产方法，其特征在于：所述MEM生长液的成份体积分数为：MEM为88％，NBCS为10％，双抗为1％，L-Glutamin为1％。

6.根据权利要求3或5所述的猪圆环病毒2型细胞悬浮培养生产方法，其特征在于：所述双抗为含10000IU/mL青霉素和10000μg/mL的链霉素溶液。

7.根据权利要求2所述的猪圆环病毒2型细胞悬浮培养生产方法，其特征在于：所述PBS缓冲液的成分与含量为：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄10mmol/L，KH₂PO₄2mmol/L，所述PBS缓冲液的pH为7.2-7.4。