[发明专利]一种人用流感病毒裂解疫苗的病毒裂解灭活方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制药领域，尤其是指一种人用流感病毒裂解疫苗生产中流感病毒单价原液的裂解灭活方法。

背景技术

流行性感冒(简称流感)是由流行性感冒病毒(Influenza virus)引起的急性呼吸道传染病,它的特点是爆发突然、传染性强，能引起较高的发病率，并可迅速传播造成大面积流行，历史上已经记载了4次世界性大流行，而近几年禽流感（Avian influenza）的不断爆发，2009年甲型H1N1 新型流感的爆发，进一步加大了各国卫生防疫的压力，引起人们的恐慌。流感是第一个实现全球性监测的传染病，但对其治疗却无特效药物，疫苗接种是预防流感流行的有效措施。流感病毒是有包膜病毒，病毒颗粒内部为核衣壳，由核蛋白、聚合酶和病毒的基因组RNA组成；包膜由双层类脂膜、糖蛋白突起和基质蛋白组成。流感病毒包膜由来自宿主细胞的双层类脂膜和流感病毒糖蛋白突起组成，流感病毒糖蛋白突起主要包括血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）。HA的抗体能抑制血凝素并能中和病毒，是最主要的保护性抗体。NA的抗体虽不能中和病毒，但能抑制病毒的繁殖，减轻症状。目前市场上流感疫苗主要有裂解灭活苗、亚单位疫苗等，其中裂解疫苗免疫效果较好，副作用较小，应用最广。

 目前国内外流感病毒的灭活从灭活剂使用上大体可分为以下几种：

一、β-丙内酯灭活：多为国外流感厂家所使用；

二、乙醚灭活：国内2家流感疫苗生产企业及日本某些流感疫苗生产企业所使用；

三、甲醛灭活：国内大多数流感疫苗企业及巴斯德所使用，是最早被使用的灭活剂；

而单就以甲醛为灭活剂的灭活方法，其灭活方式又可分为：

一、前灭活：是将流感病毒接种鸡胚，收获尿囊液后即加入甲醛灭活，该灭活方式为最传统也是国内使用最广的灭活方式。

二、浓缩液阶段灭活:是先将流感病毒超滤浓缩后，再加入甲醛灭活。

目前，传统前灭活工艺中存在如下问题：加入甲醛后，易产生病毒聚团现象，病毒裂解的均匀度不高，病毒裂解效果不佳；灭活时间长，灭活效率低；甲醛的使用量大；灭活操作步骤多，染菌风险高；所需厂房、人力和能耗较大；灭活的均一性和稳定性差。

发明内容

本发明提供一种人用流感病毒裂解疫苗的病毒裂解灭活方法，以解决目前传统前灭活工艺中存在的病毒裂解效果差、灭活时间长、灭活效率低、灭活剂的用量大、灭活操作步骤多，染菌风险增加、灭活所需厂房、设施和能耗增加、灭活的均一性和稳定性差的问题。

本发明采取的技术方案是： 

（一）、将梯密度离心纯化后的H1N1型、H3N2型或B型单价流感全病毒置于密闭容器中、其蛋白含量控制在2.0-3.0 mg/ml，加入作用浓度为0.7%-0.9%浓度的裂解剂Triton X-100或作用浓度范围为0.7-1.2%的Triton N-101；置20℃-25℃，振荡裂解；

（二）、采用震荡装置进行震荡，震荡时间为采用Triton X-100 震荡1.5-2.5h,或采用Triton N-101震荡4-5h，超滤去除裂解剂；

（三）、病毒灭活：灭活采用pH值7.2、用磷酸盐缓冲液PBS终浓度为0.1 M/L、EDTA终浓度为0.5mM/L的调配流感病毒灭活溶液,裂解后病毒液的蛋白浓度0.5-1.0mg/ml，加入终浓度为200ug/ml的甲醛，2-8℃震荡灭活，灭活时长：4-5天。

本发明所述的流感病毒灭活溶液是通过下列方法得到的：

（1）2M/L 磷酸盐缓冲液PBS的配制：

称取1600g NaCl、40g KCl、288g Na₂HPO₄和48g KH₂PO₄,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.2，最后加蒸馏水定容至1L即可；

在15lbf/in2(1034×105Pa)高压下蒸气灭菌40分钟，保存于室温或4℃冰箱中；

（2）100mM/L EDTA溶液的配制：

称取37.224gEDTA溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.2，最后加蒸馏水定容至1L即可；

在15lbf/in2(1034×105Pa)高压下蒸气灭菌40分钟，保存于室温或4℃冰箱中；

 （3）流感病毒灭活溶液的调配：