[发明专利]一种人用流感病毒裂解疫苗的病毒裂解灭活方法

权利要求书

1.一种人用流感病毒裂解疫苗的病毒裂解灭活方法，其特征在于包括下列步骤：

（一）、将梯密度离心纯化后的H1N1型、H3N2型或B型单价流感全病毒置于密闭容器中、其蛋白含量控制在2.0-3.0 mg/ml，加入作用浓度为0.7%-0.9%浓度的裂解剂Triton X-100或作用浓度范围为0.7-1.2%的Triton N-101；置20℃-25℃，振荡裂解；

（二）、采用震荡装置进行震荡，震荡时间为采用Triton X-100 震荡1.5-2.5h,或采用Triton N-101震荡4-5h，超滤去除裂解剂；

（三）、病毒灭活：灭活采用pH值7.2、用磷酸盐缓冲液PBS终浓度为0.1 M/L、EDTA终浓度为0.5mM/L的调配流感病毒灭活溶液,裂解后病毒液的蛋白浓度0.5-1.0mg/ml，加入终浓度为200ug/ml的甲醛，2-8℃震荡灭活，灭活时长：4-5天。

2.根据权利要求1所述的一种人用流感病毒裂解疫苗的病毒裂解灭活方法，其特征在于所述的流感病毒灭活溶液是通过下列方法得到的：

（1）2M/L 磷酸盐缓冲液PBS的配制：

称取1600g NaCl、40g KCl、288g Na₂HPO₄和48g KH₂PO₄,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.2，最后加蒸馏水定容至1L；

在15lbf/in2(1034×105Pa)高压下蒸气灭菌40分钟，保存于室温或4℃冰箱中；

（2）100mM/L EDTA溶液的配制：

称取37.224gEDTA溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.2，最后加蒸馏水定容至1L；

在15lbf/in2(1034×105Pa)高压下蒸气灭菌40分钟，保存于室温或4℃冰箱中；

 （3）流感病毒灭活溶液的调配：

分别将2M/L 磷酸盐缓冲液PBS20倍稀释，100mM/L EDTA溶液200倍稀释后混合，最终配成pH值7.2，PBS终浓度为0.1 M/L、EDTA终浓度为0.5mM/L的流感病毒灭活溶液。

3.根据权利要求1所述的一种人用流感病毒裂解疫苗的病毒裂解灭活方法，其特征在于还包括：裂解后纯化步骤：

采用柱色谱法进行病毒裂解后的再纯化， 色谱介质为Sepherose 4FF，每次上样量不超过柱体积的5%，以磷酸盐缓冲液PBS0.01 mol/L，pH7.2为洗脱液，流速为 300ml/分钟，在监测波长为280nm的条件下，收集全部第一蛋白峰。