[发明专利]一种两核苷酸实时合成DNA解码测序方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，是一种实现核酸序列高通量测定的方法，具体涉及一种两核苷酸实时合成DNA测序方法及其应用。

背景技术

随着人类基因组计划和各种模式生物基因组计划的开展和完成，使人类步入了后基因时代，对当代的生物学研究和医学研究产生了巨大的影响，分子生物学相关学科得到了迅猛的发展。从基因水平上认识生命的差异，疾病发生、发展的规律，以及药物与生命体的相互作用将成为可能。大幅度降低DNA测序的成本将会大大推动生命科学和医学的研究，甚至会带来革命性的变化。目前，全基因组DNA测序技术已经成为国际上一个竞争十分激烈的研究领域。如Roche公司基于乳液PCR产物的高通量并行焦测序技术；Illumina公司的桥式扩增-DNA芯片延伸测序技术；以及Applied Biosestems公司基于乳液PCR产物的杂交-酶连接-酶切割的SOLiD平台、pH敏感场效应管阵列芯片的Ion Torrent平台等高通量测序技术都有成熟的商品化仪器上市。

聚合酶链式反应(PCR)表明合成延伸反应理论上合成测序方法可以测定数千甚至上万个碱基，这无疑代表高通量核酸测序的巨大潜力。然而现有的合成测序要么是简单地每次只加一种核苷酸的方法通过确定每次合成的碱基的个数，或者通过可逆封闭核苷酸单体3端羟基的特殊单体一次只延伸一个核苷酸的方法确定每次合成的碱基种类的来实现的。前者需要四个独立的反应来完成所有模板的一个碱基的测定而增加测序时间，而后者由于在测定下一个碱基前需要将3端羟基的保护基团脱出，而每增加一步反应将导致反应效率的降低，最终导致测序长度的下降。以前，我们提出过基于标记核苷酸单体的“两核苷酸同时合成DNA测序方法及其应用”(中国发明专利申请号：201110321795.2)实施高通量DNA测序的方法来提高测序长度。然而，一方面，标记核苷酸单体、尤其是具有特定被切割性能的标记核苷酸单体其价格是商品化非标记天然核苷酸单体的数百倍以上，且引入切割反应、改变天然核苷酸结构均会对测序长度造成影响。另一方面，荧光强度不仅依赖于核苷酸合成的数目，而且也与具体的序列密切相关。例如，在最简单的两核苷酸合成片段AC与CA中，原理上它们应该给出相同的荧光比值，然而，在具体的测序操作中，当荧光标记单体以一定比例掺入后(如1/5)，在合成标记物核苷酸后面紧接着合成标记物的可能性非常少，所以第二个标记核苷酸掺入的数值则为4/5×1/5＝4/25。因此，在合成片段AC中，荧光强度(A/C)＝1/5/4/25＝1.25；而在合成片段CA中，荧光强度(A/C)＝4/25/1/5＝0.8；两者相差1.56倍。因此定量关系实际上是相当复杂的，需要对大量的不同序列进行预先的统计分析以给每种特定的序列确定一个相关系数，而这些在序列测定前又往往事先不知道。利用检测天然核苷酸单体合成反应实时产生的焦磷酸盐、氢离子而发展的454高通量测序技术(Margulies，et al.Nature，2005.437(7057)：376-380)、Ion Torrent测序技术(Rothberg，et al.Nature，475348-352)允许原始DNA的合成，核苷酸被合成后无需进行任何处理步骤。因此，测序过程相当快、准确率高，且序列阅读长度要比标记核苷酸单体的合成测序方法高数倍，目前的水平接近传统的Sanger技术。

发明内容

解决的技术问题：本发明的目的就是利用价格便宜的天然核苷酸单体为测序原料，通过一种两核苷酸实时合成DNA测序方法，实现待测核酸序列的高通量检测。整个测序包括对同一模板进行二组测序反应：每组测序由包含四个核苷酸dATP、dCTP、dGTP、dTTP，按照每个核苷酸在一个循环中只使用一次的方式，进行由两个不同核苷酸同时合成测序反应的循环，若干次测序反应后得到由一组按照测序顺序排列的若干XYⁿ信息；当该组测序反应完成后，变性将测序引物延伸链清除，重新杂交测序引物，进行第二组测序反应，得到第二组测序反应排列的若干XYⁿ信息，最后通过解码二组排列的若干XYⁿ信息组装出待测核酸序列的具体碱基信息。该方法采用价格便宜的天然核苷酸单体为测序原料，只涉及简单的合成反应、无需要对合成的核苷酸进行后续处理，且为天然核苷酸结构对后续的测序反应无任何副作用，因此测序阅读长度比荧光修饰单体的将会有明显的增加。另一方面，由于所有核苷酸合成产生的检测分子均相同，合成核苷酸的数目与产生的检测分子数量间存在简单严格的定量关系，与具体序列无关。