[发明专利]一种两核苷酸实时合成DNA解码测序方法

权利要求书

1.一种两核苷酸实时合成DNA解码测序方法，其特征在于单个测序反应由X、Y两个不同的核苷酸同时进行，依据合成核苷酸数目与实时产生的检测分子数的定量关系，得到一个碱基序列片段编码XYⁿ；所述XYⁿ信息包括该测序反应参与的核苷酸种类X、Y，以及碱基序列片段包括的碱基数目n；一个编码XYⁿ对应包括唯一的正确序列片段在内的2ⁿ个碱基序列片段；整个测序包括对同一模板进行二组测序反应：每组测序由包含四个核苷酸dATP、dCTP、dGTP、dTTP，按照每个核苷酸在一个循环中只使用一次的方式，进行由两个不同核苷酸同时合成测序反应的循环，若干次测序反应后得到由一组按照测序顺序排列的若干XYⁿ信息；当该组测序反应完成后，变性将测序引物延伸链清除，重新杂交测序引物，进行第二组测序反应，得到第二测序反应排列的若干XYⁿ信息，最后通过解码二组按照测序顺序排列的若干XYⁿ信息，组装出待测核酸片段的具体碱基序列。

2.根据权利要求1所述的两核苷酸实时合成DNA解码测序方法，其特征在于单个测序反应由X、Y两个不同的核苷酸是指由(dATP+dCTP)、(dATP+dGTP)、(dATP+dTTP)、(dCTP+dGTP)、(dCTP+dTTP)、(dGTP+dTTP)六种组合中任一种两核苷酸同时进行的合成测序反应。

3.根据权利要求1所述的一种两核苷酸实时合成DNA解码测序方法，其特征在于整个测序包括对同一模板进行二组测序反应是指(dATP+dCTP)/(dGTP+dTTP)，(dATP+dGTP)/(dCTP+dTTP)，(dATP+dTTP)/(dCTP+dGTP)三组中任意两组两核苷酸合成循环对同一模板的测序。

4.根据权利要求1所述的一种两核苷酸实时合成DNA解码测序方法，其特征在于所述核苷酸是未加任何修饰的dNTPs，或者三磷酸上标记可供检测的分子的dNTPs，所述标记为荧光基团，化学发光底物或者量子点。

5.根据权利要求1所述的一种两核苷酸实时合成DNA解码测序方法，其特征在于dNTPs合成实时产生的检测分子相同的，其检测分子是化学发光检测的焦磷酸盐，电化学检测的氢离子或者光学检测的荧光分子。

6.根据权利要求1所述的一种两核苷酸实时合成DNA解码测序方法，其特征在于待测核酸片段是指单分子，或者以单分子为模板扩增的相同序列产物。

7.根据权利要求1所述的一种两核苷酸实时合成DNA解码测序方法，其特征在于不同待测核酸序列的并行测序中，每个模板需要独立的微反应池。

8.根据权利要求1所述的一种两核苷酸实时合成DNA解码测序方法，其特征在于解码是指从XYⁿ对应的2ⁿ个碱基序列片段中找出唯一的正确序列片段的过程。

9.根据权利要求1所述的一种两核苷酸实时合成DNA解码测序方法，其特征在于待测核酸片段的具体碱基信息是通过解码二组碱基片段编码信息而得到的。

10.根据权利要求1所述的一种两核苷酸实时合成DNA解码测序方法，其特征在于步骤为：

a：全基因组模板制备：将目标基因组用超声破碎成大小为100-1000bp碱基的片段，并在连接酶的作用下将这些片段化核酸序列用一对序列已知道的通用连接子进行连接，其中连接子1的序列为：CTG CTG TAC CGT ACA GCC TTG GCC G，连接子2的序列为：CGC TTT CCT CTC TAT GGG CAG TCG GTGA T；并进行预扩增10个循环；然后凝胶电泳切割200-800bp DNA片段，并纯化；将这些200-800bp DNA片段与固定其中一个连接子互补序列的微珠进行乳液并行PCR反应，扩增片段化的大肠杆菌基因组片段，并变性得到大肠杆菌基因组测序DNA模板，最后，将这些扩增双链DNA模板的微珠放置到具有反应池的芯片上，每个反应池最多容纳一个微珠；

b.测序引物杂交：将5’端固定的模板与能和3’端连接子互补的引物杂交，杂交引物作为所有大肠杆菌基因组DNA模板的测序引物；

c.测序

第一组测序反应：将5’端固定的模板与能和3’端连接子互补的引物杂交，杂交引物作为所有大肠杆菌基因组DNA模板的测序引物；

按照循环加入dATP/dGTP、dCTP/dTTP的方法进行循环测序反应，得到由按照先后顺序排列的单个测序反应的碱基片段编码信息；

第二组测序反应：用8M尿素在65℃下处理5分钟共2次，将第一组测序反应中的测序引物、及其测序引物合成链清除，重新得到单链DNA模板，然后与测序引物进行杂交；

按照循环加入dATP/dCTP、dTTP/dGTP的方法进行循环焦测序反应，得到由按照先后顺序排列的单个测序反应的碱基片段编码信息；

d.解码

利用每个模板两组测序中得到的碱基片段编码信息，解码组装出相应的碱基序列信息；

e.序列组装

利用所有模板的碱基序列信息，组装成大肠杆菌基因组序列。