[发明专利]利用七叶苷和4-MUG从fosmid文库中筛选β-葡萄糖苷酶的方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种利用七叶苷和4-MUG从fosmid文库中筛选β-葡萄糖苷酶的方法。

(二)背景技术

β-葡萄糖苷酶可以催化水解多种β-葡萄糖苷键，具有底物广谱性和多种生物功能，比如：

(1)β-葡萄糖苷酶用于纤维素的水解

纤维素是自然界最丰富的碳资源，从纤维素分解为葡萄糖需要3种酶协同作用。β-葡萄糖苷酶可以将纤维二糖水解为葡萄糖，而纤维素酶组分中β-葡萄糖苷酶含量少，活力低，因此成为纤维素酶解的瓶颈。因此筛选或者通过基因工程改造得到高活性的β-葡萄糖苷酶对纤维素有效降解具有重要意义。

(2)β-葡萄糖苷酶制备高生物活性苷元的应用

研究发现，自然界多种具有高生物活性的物质，由于大部分以糖苷形式存在而降低了其活性。利用β-葡萄糖苷酶水解掉葡萄糖后可以得到高活性的苷元。例如，人参皂甙是人参中的主要有效成分，含量约4％，但并非所有的人参皂甙都有很高的生物活性。如具有强烈抗癌作用的人参皂甙Rh2在人参中的质量比仅为10^-5。而以低活性的人参二醇类皂甙Rg3为底物，β-葡萄糖苷酶可以水解掉一个葡萄糖后得到人参皂甙Rh2。例如，大豆异黄酮具有的很多重要的生理功能，研究发现大豆异黄酮苷元的生理活性远比其相应糖苷的活性高。大豆异黄酮中97％～99％是以大豆异黄酮糖苷形式存在，苷元形式仅为大豆异黄酮总量的1％～3％。利用β-葡萄糖苷酶可以水解大豆异黄酮糖苷为高生物活性的大豆异黄酮苷元。

传统的β-糖苷酶筛选，比如以纤维二糖为唯一碳源的筛选方法，主要是对β-糖苷酶产生菌的筛选，获得β-葡萄糖苷酶的DNA序列和氨基酸序列较慢，也就不能够重组为具有高效、高适应性的工程菌。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种利用七叶苷和4-MUG从fosmid文库中筛选β-葡萄糖苷酶的方法，该方法筛选时间短，精度高，误差少，且可以较快获得β-葡萄糖苷酶的DNA序列和氨基酸序列，进一步重组为具有高效、高适应性的工程菌。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种利用七叶苷和4-MUG从fosmid文库中筛选β-葡萄糖苷酶的方法，所述方法为：(1)从富含纤维素资源的地点采集土样，提取总DNA，构建fosmid文库，获得富集菌液；(2)将富集菌液于含七叶苷的基础培养基中，20～40℃培养12～24h进行初筛，获得菌落周围呈现黑色的菌株；所述含七叶苷的基础培养基的终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉10～20g/L，七叶苷0.1～1g/L，柠檬酸铁0.1～5g/L，氯霉素10～50mg/L，溶剂为水；(3)挑取步骤(2)获得的菌落周围呈现黑色的菌株接种至基础培养平板上，20～40℃培养12～24h进行复筛，获得复筛培养后的平板；所述基础培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉10～20g/L，氯霉素10～50mg/L，溶剂为水；(4)取3～10ml 4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷(4-MUG)的低熔点琼脂糖溶液均匀平铺在步骤(3)获得平板的上层，待琼脂糖溶液凝固后，20～40℃培养0.1～1h，紫外灯下观察菌落，菌落周围显荧光的，即获得所述β-葡萄糖苷酶产生菌株，进而获得β-葡萄糖苷酶的DNA序列和氨基酸序列，通过本领域公知的生物工程方法将β-葡萄糖苷酶的DNA序列和氨基酸序列重组为各种工程菌；若无荧光的，即为假阳性菌株；所述4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷的低熔点琼脂糖溶液的终浓度组成为：4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷0.1～1g/L，低熔点琼脂糖1～10g/L，溶剂为水，所述低熔点琼脂糖的凝胶温度为24～28℃，优选低熔点琼脂糖Agarose LM GQT。

进一步，步骤(2)所述含七叶苷的基础培养基中七叶苷的终浓度优选为0.5g/L，柠檬酸铁的终浓度优选为2g/L。

步骤(2)所述富集菌液先进行10^-3、10^-4、10^-5、10^-6倍稀释(优选10^-5倍稀释)，再分别于含七叶苷的基础培养基中进行初筛培养。

步骤(2)所述初筛温度为37℃，培养时间为24h。

进一步，步骤(3)所述复筛温度优选为37℃，培养时间优选为24h。

进一步，步骤(4)所述培养温度优选为37℃，培养时间优选为40min。