[发明专利]利用七叶苷和4-MUG从fosmid文库中筛选β-葡萄糖苷酶的方法

权利要求书

1.一种利用七叶苷和4-MUG从fosmid文库中筛选β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于所述方法为：(1)从富含纤维素资源的地点采集土样，提取总DNA，构建fosmid文库，获得富集菌液；(2)将富集菌液于含七叶苷的基础培养基中，20～40℃培养12～24h进行初筛，获得菌落周围呈现黑色的菌株；所述含七叶苷的基础培养基的终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉10～20g/L，七叶苷0.1～1g/L，柠檬酸铁0.1～5g/L，氯霉素10～50mg/L，溶剂为水；(3)挑取步骤(2)获得的菌落周围呈现黑色的菌株接种至基础培养基中，20～40℃培养12～24h进行复筛，获得复筛后的平板；所述基础培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉10～20g/L，氯霉素10～50mg/L，溶剂为水；(4)取4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷的低熔点琼脂糖溶液均匀平铺在步骤(3)获得的平板上，20～40℃培养0.1～1h，紫外灯下观察菌落，菌落周围显荧光的，即得所述β-葡萄糖苷酶产生菌株，进而获得β-葡萄糖苷酶的DNA序列，若无荧光的，即为假阳性菌株；所述4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷的低熔点琼脂糖溶液的终浓度组成为：4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷0.1～1g/L，低熔点琼脂糖1～10g/L，溶剂为水，所述低熔点琼脂糖凝胶温度为24～28℃。

2.如权利要求1所述的利用七叶苷和4-MUG从fosmid文库中筛选β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于步骤(2)所述含七叶苷的基础培养基中七叶苷的终浓度为0.5g/L，柠檬酸铁的终浓度为2g/L。

3.如权利要求1所述的利用七叶苷和4-MUG从fosmid文库中筛选β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于步骤(2)所述富集菌液先进行10^-5倍稀释，再于含七叶苷的基础培养基中进行初筛培养。

4.如权利要求1所述的利用七叶苷和4-MUG从fosmid文库中筛选β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于步骤(2)所述初筛温度为37℃，培养时间为24h。

5.如权利要求1所述的利用七叶苷和4-MUG从fosmid文库中筛选β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于步骤(3)所述复筛温度为37℃，培养时间为24h。

6.如权利要求1所述的利用七叶苷和4-MUG从fosmid文库中筛选β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于步骤(4)所述培养温度为37℃，培养时间为40min。

7.如权利要求1所述的利用七叶苷和4-MUG从fosmid文库中筛选β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于步骤(4)所述4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷的低熔点琼脂糖溶液的终浓度组成为：4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷0.4g/L，低熔点琼脂糖5g/L，溶剂为水，所述低熔点琼脂糖凝胶温度为24～28℃。

8.如权利要求1所述的利用七叶苷和4-MUG从fosmid文库中筛选β-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于步骤(4)所述4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷的低熔点琼脂糖溶液温度降至40℃时均匀平铺在步骤(3)获得的复筛培养后的菌株的平板上。